壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的： 1．構(gòu)建用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素基因的壓電石英晶體傳感器系統(tǒng)軟、硬件和針對(duì)檢測(cè)研究的三種產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因的基因芯片。 2．用多重PCR的方法對(duì)檢測(cè)的三種產(chǎn)氣莢膜毒素基因的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增，用構(gòu)建的壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)完成對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)和其三種毒素基因的檢測(cè)分型，并優(yōu)化檢測(cè)的反應(yīng)條件。 方法： 1．在前期研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建壓電石英晶體傳感器系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和電路。運(yùn)用精

2、細(xì)微加工技術(shù)制作壓電石英傳感器和2×5型傳感器矩陣單元。接入開發(fā)研制的溫度控制單元，滿足分子生物學(xué)反應(yīng)的溫度要求。使用新的頻率計(jì)數(shù)卡和USB傳輸方式，提高儀器的適用性。在PESA V2.0版頻率記錄分析軟件的基礎(chǔ)上開發(fā)壓電生物傳感器PESA-4.0軟件，完善軟件功能及軟件的易用性。 2．采用10MHz的AT切型的石英晶體，采用離子濺射的方法鍍上金膜，并且在石英晶體的定向精度控制、拋光精度控制、增加電極附著力、金膜電極尺寸以及金膜

3、厚度等生產(chǎn)工藝上進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用Arrav Designer V2.0，F(xiàn)ast PCR V3.6.5，Primer PremierV5.0，Oligonucleotide Propeities Calculator四種核酸分析和設(shè)計(jì)軟件，自行設(shè)計(jì)三種寡核苷酸探針，5'端巰基修飾。利用巰基自組裝的方法構(gòu)建檢測(cè)三種產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因的基因芯片。 3．使用試劑盒和加酶孵育后煮沸兩種方法提取產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組。根據(jù)GeneBank中已

4、經(jīng)發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因序列，運(yùn)用Arrav Designet V2.0，F(xiàn)ast PCRV3.6.5，Primer Premier V5.0，Oligonucleotide Properties Calculator四種核酸分析和設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)三對(duì)用在多重PCR反應(yīng)體系中的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素、β毒素和腸毒素基因特異性引物。研究產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增基因檢測(cè)的目的DNA序列，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并用模擬標(biāo)本和混合標(biāo)本對(duì)

5、反應(yīng)體系可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。 4．運(yùn)用構(gòu)建的壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增得到的目的DNA序列，并對(duì)反應(yīng)條件：PH值，離子強(qiáng)度、反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化研究。運(yùn)用優(yōu)化后的反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌模擬標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建新型的壓電石英晶體傳感器檢測(cè)系統(tǒng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片。檢測(cè)系統(tǒng)外形美觀、結(jié)實(shí)耐用，操作方便，布置便利。溫度控制單元有效可控溫度范圍20～70攝氏度，精度為±0.5攝氏度，

6、從20℃到70℃時(shí)，平衡時(shí)間≤45分鐘。檢測(cè)系統(tǒng)和基因芯片性能穩(wěn)定，在氣相中檢測(cè)波動(dòng)值≤±2Hz，2小時(shí)頻率漂移≤±5Hz，在液相中波動(dòng)值≤±5Hz，2小時(shí)頻率漂移≤±10Hz，可以滿足基因檢測(cè)的需要。 2．編程的壓電生物傳感器分析系統(tǒng)PESA-4.0軟件正常運(yùn)行在windows操作系統(tǒng)中，界面友好，各個(gè)功能較完善且直觀易用，各個(gè)窗口布置合理且各項(xiàng)數(shù)據(jù)圖像顯示清晰，能夠滿足壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的使用要求

7、。 3．多重PCR擴(kuò)增模擬標(biāo)本和混合標(biāo)本所得DNA序列經(jīng)電泳鑒定，序列大小為120bp、291bp、220bp，與預(yù)期序列大小一致。說明該多重PCR體系設(shè)計(jì)成功，能夠適應(yīng)檢測(cè)工作的需要。同時(shí)，使用兩種方法提取得到的基因模板擴(kuò)增結(jié)果一致性好，選擇加酶煮沸的方法更加簡(jiǎn)便快捷和廉價(jià)。 4．運(yùn)用構(gòu)建的壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌，最佳PH值為7.6，最佳離子強(qiáng)度為0.64mol/L的Na離子，最

8、佳的反應(yīng)溫度為37℃。在最適反應(yīng)條件下檢測(cè)頻率有明顯下降，三種基因芯片檢測(cè)的頻率下降大小與其檢測(cè)的目的DNA序列大小一致。并且基因芯片的檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照差異顯著，其頻率變化值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組最大頻率變化值的2倍。說明三種基因芯片功能正常，壓電石英晶體檢測(cè)系統(tǒng)能夠有效檢測(cè)出產(chǎn)氣莢膜梭菌，并能分型鑒定三種不同的毒素。 結(jié)論： 1．構(gòu)建的壓電石英晶體傳感器檢測(cè)系統(tǒng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片硬件設(shè)計(jì)較完善，工作穩(wěn)定，計(jì)數(shù)電路計(jì)數(shù)準(zhǔn)