產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素突變基因重組乳酸桿菌的構建及其免疫學評價.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是廣泛存在自然界的一種常見的條件性致病菌，能夠引起動物產(chǎn)生壞死性腸炎、腸毒血癥等，同時也是導致人類食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。按毒素型分類，可將其分為A、B、C、D、E五個型，目前，已發(fā)現(xiàn)的外毒素至少有13種，其中α、β、ε和ι是主要的外毒素。ε毒素由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生，是D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素，同時也是一種孔毒素，對MDCK(犬腎細胞)具有致死作

2、用。
　　 為研究突變的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素(mε)的抗體是否具有中和作用，本研究以毒素D型產(chǎn)氣莢膜梭菌全基因組DNA為模板，應用重疊延伸PCR技術(SOE-PCR)將ε毒素第106位的組氨酸殘基定點突變成脯氨酸殘基，擴增出mε基因，使其喪失生物學毒性而保持其免疫原性。以pET-28a作為表達載體，構建了重組表達質粒pET-mε，并轉入大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導表達重組mε毒素蛋白，SDS-PAGE及western blot分析顯

3、示，表達的重組蛋白大小約39 ku，主要以包涵體形式存在。將重組蛋白免疫家兔，所制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌mε毒素蛋白的抗血清經(jīng)10倍稀釋后，與2倍最小致死量(MLD)的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清等體積混合時，能夠有效中和ε毒素。這些結果表明，重組突變的ε毒素具有較強的抗原性，這為產(chǎn)氣莢膜梭菌候選亞單位疫苗的研究及其血清學診斷方法的建立奠定了基礎。
　　 根據(jù)乳酸桿菌密碼子使用的偏愛性，對ε毒素突變基因進行了優(yōu)化并合成。以pPG-2作為其表達

4、載體，構建了重組表達質粒pPG-2-mε，并電轉化至戊糖乳桿菌L.pentosus及干酪乳桿菌L.casei中，成功構建重組戊糖乳桿菌pPG-2-mε/L.pentosus及重組干酪乳桿菌pPG-2-mε/L。pentosus。將構建的兩種重組乳酸桿菌通過1％乳糖誘導進行目的蛋白的表達，SDS-PAGE結果顯示，均有大小約39ku的融合蛋白表達，所表達蛋白的大小與理論值相符。Western blot鑒定結果表明，這兩種重組菌表達的蛋白均

5、可被產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素兔抗血清所識別，證實了ε毒素在兩種乳酸桿菌中確實得到了表達。
　　 為探討表達產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素蛋白的重組戊糖乳桿菌系統(tǒng)及重組干酪乳桿菌系統(tǒng)作為活菌疫苗潛在的應用價值，本實驗以BALB/c小鼠作為實驗動物，進行口服免疫實驗。實驗組Ⅰ口服重組戊糖乳桿菌，實驗組Ⅱ口服干酪乳桿菌，實驗組Ⅲ口服PBS作為對照。共免疫三次，每隔2w免疫一次，每次連續(xù)免疫3d。免疫后分別測定各組小鼠在第4、5、6、8、10、12、18

6、、19、20、22、24、26、32、33、34、36、38、40d時的糞便、鼻腔沖洗液及陰道沖洗液中抗ε毒素的特異性sIgA水平以及血清中抗ε毒素的特異性IgG水平。ELISA檢測結果表明，經(jīng)口服免疫重組戊糖乳桿菌及重組干酪乳桿菌的小鼠，在其糞便、鼻腔沖洗液及陰道沖洗液中均檢測到了特異性sIgA抗體，并在其血清中也檢測到了較高水平的特異性IgG抗體。這表明重組戊糖乳桿菌系統(tǒng)及重組干酪乳桿菌能夠有效刺激機體產(chǎn)生局部黏膜免疫應答和體液免疫