高濃度甘油發(fā)酵1,3-丙二醇菌株的篩選及其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、1，3-丙二醇(1，3-PD)是目前國際上公認(rèn)的六大石化新產(chǎn)品之一，其主要用途是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。1，3-PD的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法。其中，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1，3-PD具有生物積累快、轉(zhuǎn)化時(shí)間短、轉(zhuǎn)化表達(dá)效率高和便于工業(yè)化生產(chǎn)等顯著優(yōu)點(diǎn)。目前，以甘油為基質(zhì)的1，3-PD發(fā)酵生產(chǎn)成為1，3-PD生物生產(chǎn)的主要方式，但是，普遍存在生產(chǎn)菌株甘油耐受濃度低、副產(chǎn)物多和下游提取途徑復(fù)雜等問題，因此，找尋高濃度甘油耐

2、受菌，提高發(fā)酵基質(zhì)濃度，優(yōu)化發(fā)酵過程，增強(qiáng)1，3-PD發(fā)酵效益，實(shí)現(xiàn)過程清潔生產(chǎn)是當(dāng)前該領(lǐng)域研究關(guān)注的重要問題。本文從篩選高產(chǎn)1，3-PD的高濃度甘油耐受菌株出發(fā)，采用過程優(yōu)化技術(shù)和代謝途徑分析手段建立1，3-PD的高效率發(fā)酵生產(chǎn)過程，研究取得了以下結(jié)果。
　　1、篩選到耐受高濃度甘油的1，3-丙二醇高產(chǎn)菌株
　　依據(jù)代謝途徑分析結(jié)果，遵循生態(tài)適應(yīng)原理，通過多點(diǎn)采樣和多循環(huán)馴化，篩選到一株高產(chǎn)1，3-PD的高濃度甘油耐受菌株

3、，該菌株甘油耐受濃度最高可達(dá)到250g/L，經(jīng)常規(guī)鑒定和16SrRNA基因同源性分析確定為Klebsiella屬菌株，編號為Klebsiella D1。
　　2、優(yōu)化了生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)基組成和主要工藝條件
　　采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察Klebsiella D1菌株的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組分，優(yōu)化了初始培養(yǎng)中營養(yǎng)基質(zhì)的種類。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了培養(yǎng)基組分的構(gòu)成比例。優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基配方為:K2HPO41.3g

4、/L，KH2PO41.5 g/L,(NH4)2SO43g/L,CaCl20.05 g/L,FeSO40.006g/L，酵母膏1.93 g/L,甘油50.30 g/L;優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:KH2PO41.5g/L，K2HPO43.4 g/L，(NH4)2SO43 g/L，CaCl20.047 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，酵母膏1.2 g/L，甘油224.22 g/LL。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)比優(yōu)化前的1，3-PD產(chǎn)量提高了58.9

5、2％，采用的甘油濃度比現(xiàn)有的報(bào)道提高了109.8％。實(shí)驗(yàn)還利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了菌種發(fā)酵的工藝條件，優(yōu)化的最適發(fā)酵條件為:pH7.0、搖瓶裝液量40ml/250ml三角瓶、發(fā)酵溫度37℃。最終獲得的1，3-PD發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到29.46 g/L。
　　3、建立了1，3-PD發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)模型
　　在優(yōu)化的發(fā)酵過程中間檢測甘油基質(zhì)的消耗速率、菌體生長速率和產(chǎn)物的生成速率，建立了發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。通過動(dòng)力學(xué)模型的擬合表明該菌種發(fā)酵生產(chǎn)1

6、，3-PD與細(xì)胞生長呈部分相偶聯(lián)模式，屬于典型的Ⅱ型發(fā)酵模型，菌體比生長速率與產(chǎn)物比合成速率呈qp=2.234u-0375關(guān)系。
　　4、探討了菌種合成1，3-PD的代謝途徑
　　根據(jù)代謝產(chǎn)物的分析進(jìn)一步明確了該菌種合成1，3-丙二醇的代謝途徑，分析了菌種體內(nèi)的代謝通量分布。研究考察1，3-PD發(fā)酵過程中除合成1，3-PD產(chǎn)物外還同時(shí)合成甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等其他有機(jī)酸，未檢測到丁酸、正丁醇和2，3-丁二醇。說明