蛻皮激素和保幼激素對誘導家蠶絲蛋白基因表達作用的研究.pdf

1、蛻皮激素（Ecdysone，20-hydroxyecdysone，20E）和保幼激素（Juvenile hormone，JH）協(xié)同調控昆蟲的生長發(fā)育。其中，昆蟲絲物質合成和分泌的過程也受到激素的調控。蛻皮激素通過由蛻皮激素受體（Ecdysone receptor，EcR）和超氣門蛋白（Ultraspiracle，USP）組成的異源二聚體發(fā)揮作用。保幼激素（Juvenile hormone，JH）能特定結合到USP蛋白，引起受體分子構象改

2、變，起到促進二聚化穩(wěn)定受體二聚體的作用。
　　家蠶是重要的產生絲物質的經濟昆蟲，但蛻皮激素和保幼激素協(xié)同調控家蠶絲蛋白基因表達的機制還不清楚。為了研究20E和JH對家蠶絲蛋白基因的表達調控，本實驗通過實時定量PCR技術分別檢測了激素處理后中部絲腺Ser-1基因及后部絲腺Fib-H、Fib-L和P25基因的表達水平；為了識別出絲蛋白基因啟動子上的蛻皮激素響應元件（Ecdysone response element，EcRE），通過等

3、溫量熱滴定（Isothermal titration calorimetry，ITC）技術分別檢測了純化后的蛻皮激素受體和超氣門蛋白（EcR-B1D/USPD）結構域蛋白復合體與預測的家蠶絲蛋白基因EcREs的相互作用,還對20E-EcR-B1D/USPD-EcRE調控模型做了進一步地分析。結果如下：
　　1.體外條件下中部絲腺經激素處理后Ser-1基因的表達特征分析
　　為了研究激素處理后Ser-1基因在中部絲腺的表達特征

4、，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲中部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。研究發(fā)現，不同濃度的20E或JH處理后，Ser-1的表達均受到抑制；然而，20E和JH共同處理后，Ser-1的表達在72 h明顯上調，這表明，20E和JH共同作用更有利于提高絲蛋白基因的表達。
　　2.體外條件下后部絲腺經激素處理后Fib-H、Fib-L和P25基因的表達特征分析
　　2.1激素對Fib-H基因表達的影響
　　為了研究激素處理后Fib-

5、H的表達變化，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲后部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。結果表明，不同濃度的20E或JH處理后，Fib-H的表達均受到抑制。20E和JH共同處理后，Fib-H的表達均在72 h顯著提高。以20E處理24 h后轉入含有20E和JH的培養(yǎng)基共同處理，或者以JH處理24 h后轉入含有20E和JH的培養(yǎng)基共同處理，這兩種處理對Fib-H表達的影響沒有明顯差異。
　　2.2激素對Fib-L基因表達的影響
　　為

6、了研究激素處理后Fib-L的表達變化，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲后部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。結果表明，0.1μg/mL20E對Fib-L的表達沒有明顯影響，0.5μg/mL和2.5μg/mL濃度的20E不同程度的促進了Fib-L的表達；不同濃度的JH對Fib-L的表達均有抑制作用。
　　另外，研究發(fā)現，0.5μg/mL20E和0.5 ng/mL JH共同處理對Fib-L的表達存在抑制作用，0.5μg/mL20E和5 n

7、g/mL JH處理組及0.1μg/mL20E和5 ng/mL JH處理組促進了Fib-L的表達，并且后者的促進效果更明顯，這表明20E和JH對Fib-L的調控有濃度依賴性；以20E處理24 h后轉入含有20E和JH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促進了Fib-L的表達，然而以JH處理24 h后轉入含有20E和JH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)抑制了Fib-L的表達，這表明激素處理的先后對Fib-L的表達存在顯著影響。
　　2.3激素對P25表達的影響
　　為

8、了研究激素處理后P25的表達變化，本研究體外培養(yǎng)了家蠶五齡幼蟲后部絲腺，在培養(yǎng)基中加以不同激素處理。結果表明，不同濃度的20E對P25的表達有促進作用，不同濃度的JH對P25基因的表達有抑制作用。
　　另外，研究發(fā)現，0.5μg/mL20E和0.5 ng/mL JH共同處理對P25的表達有抑制作用，而0.5μg/mL20E和5 ng/mL JH處理組及0.1μg/mL20E和5 ng/mL JH處理組促進了P25的表達，并且后者的

9、促進效果更明顯，這表明20E和JH對P25的調控有濃度依賴性；在以20E處理24 h后轉入含有20E和JH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)或者以JH處理24 h后轉入含有20E和JH的培養(yǎng)基中對P25的表達沒有明顯差別，這表明激素處理先后對P25表達的影響沒有明顯差別。
　　3.蛻皮激素受體結構域EcR-B1D和超氣門蛋白結構域USPD的共表達
　　本研究克隆USPD基因片段并連接到pET-28a載體上，轉化E.coli BL21(DE3)，

10、然后用EcR-pET21b-MDX12重組質粒轉化含有USP-pET-28a(+)的E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。IPTG誘導重組蛋白表達，利用SDS-PAGE和Western blot鑒定表達結果。使用Ni-NTA親和層析柱純化，得到了EcR-B1D/USPD蛋白復合物，純度達到95％。4. EcR-B1D/USPD與絲蛋白基因蛻皮激素響應元件（EcREs）的結合反應
　　在體外條件下通過ITC獲得了EcR-B1D/U

11、SPD蛋白與預測的家蠶絲蛋白基因EcREs相互作用的一系列熱力學參數包括親和力常數（K）、反應熱（ΔH）和熵（ΔS）。EcR-B1D/USPD蛋白能夠與預測的絲蛋白基因的EcREs進行結合，結果表明，預測的序列TTTTC、TCTTT、ACTTT、TTTTC可能分別是Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1基因EcRE的關鍵序列，并且該序列是保守的。
　　5.20E與EcR-B1D/USPD復合體及EcRE的模型分析
　　在

12、體外條件下通過 ITC研究發(fā)現，20E能與 EcR-B1D/USPD二聚體結合，EcR-B1D/USPD二聚體能與EcRE結合，20E-EcR-B1D/USPD組成的復合體也能與EcRE結合。這為20E通過EcR-B1D/USPD誘導絲蛋白基因表達的這種模式提供了新的證據。
　　本研究從轉錄水平上詳細闡明了20E及JH對Ser-1、Fib-H、Fib-L和P25基因表達作用的基本規(guī)律。另外，通過ITC技術檢測了EcR-B1D/US