三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素濃度的變化【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮周期中蛻皮激素濃度的變化 </p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物技術 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄<

3、/b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料和方法1</b></p><p><b>　　2.1 材料1</b></p><p>　　2.2 主要儀器設備與試劑1</p><p>　　2.3 實驗

4、方法2</p><p>　　2.3.1 標準溶液的配制2</p><p>　　2.3.2色譜和質譜條件UPLC條件3</p><p>　　2.3.3標準曲線和檢出限3</p><p>　　2.3.4血淋巴蛻皮激素濃度的變化的測量3</p><p><b>　　3實驗結果3</b><

5、;/p><p>　　3.1 檢測獲得的蛻皮激素濃度3</p><p>　　3.2數(shù)據(jù)分析結果4</p><p><b>　　4結論5</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻5</b></p><p&g

6、t;　　附錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：甲殼動物Y器(Y-organ)分泌的蛻皮類固醇激素對其蛻皮過程起重要調控作用。利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）法完成三疣梭子蟹蛻皮過程中血淋巴蛻皮激素濃度變化的測定。隨著蛻皮周期的運行基本處于逐漸升高的趨勢，蛻皮后期(A/B)蛻皮激素的濃度較低，低于儀器檢測限0.03ng/mL。進入蛻皮間期后，蛻皮激素的濃度開始逐漸恢復正常1.393

7、±0.245ng/mL。進入蛻皮前期蛻皮激素濃度逐漸上升，D0，D1，D2其濃度分別為4.547±0.372ng/mL，6.406±0.438ng/mL和8.135±0.423ng/mL；而在蛻皮前期D3期達到最高峰20.071±1.327ng/mL，D4有所回落變?yōu)?0.313±0.511ng/mL。該研究結果證實蛻皮類固醇激素對三疣梭子蟹蛻皮過程起重要調控作用。</p

8、><p>　　關鍵詞：三疣梭子蟹；蛻皮周期；蛻皮激素；LC-MS/MS</p><p>　　Abstract: Crustacean Y control (Y-organ) steroid hormone secreted by their molting molting process plays an important regulatory role.High performance l

9、iquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method to complete the process of Portunus trituberculatus molting ecdysteroid hemolymph concentration determination. With the molt cycle, running basically at t

10、he increasing tendency, molt later (A/B) low concentrations of ecdysone, below the instrument detection limit of 0.03 ng/mL. Int</p><p>　　Key words: Portunus trituberculatus；moulting cycle；ecdysone；LC-MS/MS&

11、lt;/p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）屬節(jié)肢動物門（Arthropods）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunidae），分布于我國遼東半島、山東半島到廣東、廣西的各海區(qū)以及日本、朝鮮、馬來西亞群島等海域，是一種大型海產經(jīng)濟蟹類。作為重

12、要的大型經(jīng)濟蟹類，三疣梭子蟹肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，食用價值高，不僅是我國傳統(tǒng)的名貴海鮮，也是一種重要的出口海產品。20世紀90年代中期開始，三疣梭子蟹的大規(guī)模育苗和養(yǎng)殖在我國逐漸推廣，現(xiàn)今三疣梭子蟹已是世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大的海洋經(jīng)濟蟹類之一。</p><p>　　蛻皮激素是一種類固醇激素，它既存在于無脊椎動物（主要是節(jié)肢動物）中，也存在于植物中。甲殼動物蛻皮激素由Y器（又稱為蛻皮腺，與昆蟲的前胸腺為同功器官）合成、分

13、泌[1,2]。目前國內已有人對甲殼動物蛻皮腺及蛻皮激素做了一些研究，如葉海輝等[1]采用組織切片和電鏡技術，對鋸緣青蟹大顎器、Y器的形態(tài)結構進行了觀察，以及陸劍峰、趙維信[3]對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）Y-器官在蛻皮周期中的超微結構，進而指出其對蛻皮過程的影響。目前尚無人研究三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的蛻皮周期，作為中國沿海重要的經(jīng)濟蟹類，剛蛻完殼的軟殼蟹的體積比蛻殼前增加了

14、30%-40%,其殼通過環(huán)境中的鈣鹽等不斷硬化而恢復正常硬度，三疣梭子蟹的個體增長在外表上并不連續(xù)，而是呈階梯形，每蛻一次皮，上一個臺階。由此可見，三疣梭子蟹的生長發(fā)育與蛻皮息息相關，促進蛻皮的發(fā)生，可促進其發(fā)育成熟，提高產量。了解蛻皮發(fā)生的時間，周期的長短對促進沿海三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展非常重要。</p><p>　　節(jié)肢動物的蛻皮激素主要是指20-羥基蛻皮酮（20E），有關研究多集中于它對人類和各種動物種類的

15、促進生長作用方面。臨床研究表明，20E可以很好地促進生物生理代謝,而且不產生副作用。但甲殼類蛻皮激素濃度達到200-400mg/L時，會出現(xiàn)外皮加厚等中毒現(xiàn)象。因此，應關注蛻皮激素在甲殼動物中的含量變化，水產養(yǎng)殖過程中應保證生物體內蛻皮激素含量處于合適的范圍內[4]。1953年Gabe首次描述了58種軟甲亞綱（Malacostraca）種類的Y器，而切甲亞綱（Entomostraca）種類沒有Y器[5]。Y器分泌的蛻皮類固醇不具生物活性

16、，只有進入血淋巴，在外周組織20-羥化酶的催化作用下才轉化成具有生物活性的20-羥蛻皮酮[6]。即是說Y器官產生a-蛻皮酮，進入血液后轉化為活性物質、實際的蛻皮激素是20羥蛻皮酮（β-蛻皮酮）。Y器官能從血液中吸收由食物中獲得的膽固醇合成類固醇激素。脊椎動物類固醇激素在血液中通常是與攜帶蛋白結合在一起運輸?shù)?，而在甲殼動物血液中還未發(fā)現(xiàn)與類固醇激素結合的蛋白，至少95％的此類激素是自由運行的。研究表明，20-羥蛻皮酮不僅參與甲殼動物的蛻皮

17、活動和胚胎發(fā)育，而且參與了</p><p>　　本文利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）法完成三疣梭子蟹蛻皮過程中血淋巴蛻皮激素濃度變化的測定，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，為海洋甲殼動物蛻皮等生長發(fā)育過程的生理學研究提供參考。</p><p><b>　　2材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 材料<

18、;/b></p><p>　　三疣梭子蟹自海中捕撈后在寧波寧海長街得水育苗場養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)，雌雄各半。體寬在9-11cm之間，體重在45-65g之間，放養(yǎng)在相同條件的育苗池內，海水鹽度、水溫以及水體溶解氧濃度、喂食量等相同，并且保證池內的梭子蟹都能正常生長發(fā)育，從而減小因為不同環(huán)境條件而造成的誤差。本實驗用水為寧海縣得水水產苗種場蟹苗池海水，該海水取自自然海區(qū)，經(jīng)過幾天的沉淀池暗沉淀和兩次砂濾池過濾。海水進入

19、育苗池后用增氧泵進行水體增氧，保證水體的溶解氧充足。實驗樣本均為未經(jīng)過生殖蛻皮的三疣梭子蟹。</p><p>　　2.2 主要儀器設備與試劑</p><p>　　OLYMPUS CX21FS1顯微鏡；</p><p>　　ppendorf AG 22331 Hambury 24500離心機；</p><p>　　OPLENIC5818觀測目鏡

20、；</p><p>　　TSQ Quantum Access液相色譜一三重四極桿質譜聯(lián)用儀（Thermo Finnigan公司），配有ESI源；</p><p>　　超純水系統(tǒng)（法國MILLIPORE公司）；</p><p>　　20-羥基蛻皮酮和高油菜素內酯標準品（純度>98%，美國SIGMA-ALDRICH公司）；</p><p>

21、　　乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；</p><p>　　純水由超純水系統(tǒng)制備；</p><p>　　其他試劑均為國產分析純，生物冰袋冰盒。</p><p><b>　　2.3 實驗方法</b></p><p>　　蛻皮的整個過程包括蛻去舊甲殼，個體由于吸水迅速增大，然后新甲殼形成并硬化。因此甲殼動物的個體增長在外形

22、上并不連續(xù)，呈階梯形，每蛻一次皮，上一個臺階。參照傳統(tǒng)甲殼動物蛻皮階段的劃分，結合三疣梭子蟹類本身所獨有的特點，以游泳足末節(jié)新舊表皮間距/舊表皮厚度的比值為主要依據(jù)，將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮后期（A和B），蛻皮間期(C)，蛻皮前期（D0，D1，D2，D3和D4）以及蛻皮期（E）等四個階段[12]。</p><p>　　目前檢測生物體內蛻皮激素的方法有薄層掃描法、放射免疫測定法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜

23、法等[13,14]。液相色譜法和薄層掃描法靈敏度較低，而放射化學法無法進行精確定性分析，并且三疣梭子蟹抗原抗體的的制備比較繁瑣。雖然國際上有更好的高效液相色譜-三重四級桿質譜分析方法等，但針對于三疣梭子蟹本方法液相色譜-質譜分析方法操作簡便，靈敏度高，抗干擾能力強，已經(jīng)應用于哺乳動物及昆蟲體內蛻皮激素的痕量檢測[14]。</p><p>　　LC/MS 的聯(lián)用始于70年代，90年代以來，由于大氣壓電離的成功應用以

24、及質譜本身的發(fā)展，液相色譜與質譜的聯(lián)用，特別是與串聯(lián)質譜（MSPMS）的聯(lián)用得到了極大的重視和發(fā)展。LC–MS/MS 聯(lián)用的優(yōu)點非常顯著，因為氣相色譜只能分離易揮發(fā)且不分解的物質，而液相色譜則把分離范圍大大拓寬了，生物大分子也能分離，LC與高選擇性、高靈敏度的MS/MS結合，可對復雜樣品進行實時分析，即使在LC難分離的情況下，只要通過MS1及MS2對目標化合物進行中性碎片掃描，則可發(fā)現(xiàn)并突出混和物中的目標化合物,顯著提高信噪比[15]。

25、</p><p>　　本實驗采用電噴霧電離(ESI)接口，圖1為ESI示意圖。溶液中樣品流出毛細管噴口后，在霧化氣(N2 )和強電場(3～6kV)作用下，溶液迅速霧化并產生高電荷液滴。隨著液滴的揮發(fā)，電場增強,離子向液滴表面移動并從表面揮發(fā)，產生單電荷或多電荷離子。通常小分子得[M+H]+或[M-H]-單電荷離子，生物大分子產生多電荷離子，由于質譜儀測量的是質P荷比(m/z)，可測定的生物大分子的質量數(shù)高達幾十萬

26、。ESI是很軟的電離，可直接測定熱不穩(wěn)定的極性化合物，多電荷形成可分析蛋白質和DNA等生物大分子，調節(jié)離子源(源內ID)電壓可以控制離子的斷裂，給出結構信息。</p><p>　　圖1電噴霧電離示意圖</p><p>　　Fig.1 Schematic diagram of electrospray ionization</p><p>　　2.3.1 標準溶液的配

27、制 </p><p>　　準確稱取5.0mg20E標準品，以甲醇溶解并定容至1.0 mL，配制成5g/L標準儲備液，置4 ℃冰箱中保存。制作工作曲線時，用甲醇將此儲備液稀釋成不同濃度的標準溶液,每份標準溶液中加入高油菜素內酯，使其含量達到100 mg/L。</p><p>　　圖2 20-羥基蛻皮酮(a)和高油菜素內酯(b)的結構式</p><p>　　Fig.2

28、Structures of 20-hydroxyecdysone(a)and 22(S), 23(S)-homobrassinolide(b)</p><p>　　2.3.2色譜和質譜條件UPLC條件</p><p>　　Hypersil Gold C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 mm，美國Thermo Fisher Scientific 公司)，進

29、樣量10m，柱溫40℃，流動相為0.5%乙酸(A)和乙腈(B)，流速0.2 mL/min。梯度洗脫：0-8 min，10% -100% B；8-10 min，100% B；10-12 min，100% -10% B；12-16 min，10% B。</p><p>　　Q-TOF MS條件：采用電噴霧電離源負離子電離模式，毛細管電離電壓2.3 kV，取樣錐孔電壓25 V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度250℃，脫

30、溶劑氮氣流速400L/h，錐孔反吹氮氣。四極桿掃描范圍m/z200-1000，碰撞室能量4V，TOF離子飛行方式采用V模式。分別提取m/z 407.2和437.2作為皮質醇和地塞米松定量目標離子，使用亮腦啡肽（m/z 554.2615）作為外標物對目標離子進行精確質量鎖定。</p><p>　　Q-Q-Q MS條件：采用電噴霧電離源負離子電離模式，離子化條件與Q-TOF MS條件同。采用MRM多反應監(jiān)測方式，皮質

31、醇定量離子對m/z 407.2/331.4，碰撞能量l8 V，定性輔助離子對m/z 407.2/361.5，碰撞能量l2 V；地塞米松定量離子對m/z 437.2/361.5，碰撞能量l8 V。各離子對駐留時間均為200 ms[14]。</p><p>　　2.3.3標準曲線和檢出限</p><p>　　分別配制含1，5，10，20和50 mg/L 20E及100 mg/L高油菜素內酯的混

32、合標準溶液,采用上述質樸條件進行LC-MS 分析。在0-50 mg/L 范圍內線性方程式為Y =0.8013X-0.1768，相關系數(shù)R2 =0.9978。由于甲殼動物蛻皮激素含量通常很低,均在相應的線性范圍內，故采用此標準曲線對三疣梭子蟹血淋巴中的蛻皮激素進行定量分析。對10 mL0.2 mg/L 20E標準樣品進行分析，測得20E(m/z 481.2)定量特征碎片離子(m/z 445.2)的信噪比S/N=18。將對應S/N=3的標準

33、樣品量作為檢出限,可算出本方法20E的檢出限為0.03 mg/L[3]。</p><p>　　2.3.4血淋巴蛻皮激素濃度的變化的測量</p><p>　　分別從蟹的游泳足基部抽取300μL血淋巴，加入含有1200μL乙腈和20μL 100ng/mL內標物高油菜素內酯的1.5 mL離心管內，輕微渦旋震蕩，8500r/min 高速離心15min。而后吸取上清液1mL（勿將底部蛋白吸入）于滅菌

34、1.5mL離心管中，做好標記冰箱下層-20℃保存，在一個星期之內送回寧波大學，而后將上清液旋轉蒸發(fā)，用0.2mL純甲醇復溶，進行液質分析。根據(jù)樣品中20-羥基蛻皮酮（20E）特征離子響應強度與內標物高油菜素內酯的特征離子響應強度比值，用加入內標的工作曲線法求得樣品中20-羥基蛻皮酮的含量。</p><p><b>　　3實驗結果</b></p><p>　　3.1 檢

35、測獲得的蛻皮激素濃度</p><p>　　根據(jù)儀器測得的蛻皮激素峰面積和內標峰面積的比值，以及建立方法時獲得的標準曲線的方程，計算獲得各個樣品中蛻皮激素的濃度（單位：ng/mL）結果見下表：</p><p>　　表1蛻皮各階段血淋巴中蛻皮激素濃度（單位：ng/mL）</p><p>　　Tab.1 Ecdysteroids in the hemolymph of i

36、ndividual crabs (unit: ng/mL)</p><p>　　整個蛻皮階段蛻皮激素的變化趨勢是比較明顯的，隨著蛻皮周期的運行基本處于逐漸升高的趨勢，蛻皮后期(A/B)蛻皮激素的濃度較低，低于儀器檢測限0.33pg。進入蛻皮間期后，蛻皮激素的濃度開始逐漸恢復正常1.393±0.245ng/mL。進入蛻皮前期蛻皮激素濃度逐漸上升，D0，D1，D2其濃度分別為4.547±0.372

37、ng/mL，6.406±0.438ng/mL和8.135±0.423ng/mL；而在蛻皮前期D3期達到最高峰20.071±1.327ng/mL，D4有所回落變?yōu)?0.313±0.511ng/mL。</p><p><b>　　3.2數(shù)據(jù)分析結果</b></p><p>　　同一樣本三疣梭子蟹不同蛻皮周期蛻皮激素濃度進行單因素方差

38、分析，認為P<0.05時存在顯著性差異，P< 0.01時存在極顯著差異。</p><p>　　圖3 各樣本蛻皮周期濃度變化</p><p>　　Fig.3 Concentration of the molt cycle of the samples</p><p>　　如圖3所示，蟹血淋巴中20E在蛻皮前期D3呈現(xiàn)一個峰值，這與該時期水溫逐漸回升，促進蛻

39、殼和加速生長有關，生長基本上呈直線上升，顯示了這階段的蟹快速生長無不與20E濃度水平升高有關。因此，為了提高蟹養(yǎng)殖產量，在提供蟹的飼料中添加一定量的20E[2]，使蛻殼頻數(shù)增加，既能促進蟹生長，加大個體重量，增大上市規(guī)格，又能達到同步蛻皮的目的，減少非同步蛻殼而造成的相互殘殺，減少死亡率，這為進一步開發(fā)餐養(yǎng)殖業(yè)提供了理論依據(jù)和新的資料。</p><p><b>　　4結論</b></p

40、><p>　　三疣梭子蟹和其他甲殼動物一樣，其生長主要是通過蛻皮來實現(xiàn)的，且其大部分生理過程與蛻皮激素所控制的蛻皮周期有關。甲殼動物在一個蛻皮周期中，體內蛻皮激素含量隨之發(fā)生周期性變化，這在許多甲殼動物中已得以證明[16-18]。蛻皮類固醇激素對三疣梭子蟹蛻皮過程起重要調控作用，分泌的蛻皮激素決定了蛻皮的程度。蛻皮激素在血液中的濃度變化有一個普遍規(guī)律，即在蛻皮前期，蛻皮激素在血液中的濃度逐漸升高，在臨近蛻皮時，形成一

41、個峰值，然后濃度迅速下降。在實際蛻皮時，處于低濃度狀態(tài)。至于蛻皮激素含量在整個生長發(fā)育階段是否存在周期性變化，尚缺乏研究[19,20]。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 葉海輝,李少菁,黃輝洋,等.鋸緣青蟹Ｙ器結構與卵巢發(fā)育的研究[J].廈門大學學報, 2002, 41(6):791-795.</p><p

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