β-抑制蛋白1及蛋白激酶B(PKB-Akt)在棉鈴蟲蛻皮激素信號通路中的功能研究.pdf

1、研究背景、存在的科學(xué)問題及研究意義:
　　昆蟲的發(fā)育過程受到三大激素:蛻皮激素(20-羥基蛻皮酮，20-Hydroxyecdysone，20E)，保幼激素(Juvenile hormone，JH)以及胰島素(insulin)共同調(diào)控。其中20E是一種重要的昆蟲激素，它在昆蟲蛻皮變態(tài)過程中起著重要的作用。20E以自由擴散的方式進入細胞核結(jié)合蛻皮激素核受體(ecdysonereceptor，EcR)，EcR結(jié)合超氣門蛋白(ultras

2、piracle protein，USP)形成異二聚體，啟動蛻皮激素接受子3(Hormone receptor3，HR3)，以及Broad等一系列基因轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過級聯(lián)信號傳遞啟動蛻皮和變態(tài)的生理過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)20E在基因組信號通路啟動前會先啟動G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCR)介導(dǎo)的非基因組信號通路，引起包括鈣離子內(nèi)流和蛋白質(zhì)磷酸化。20E通過蛻皮激素響應(yīng)的GPCR(Ecdysone r

3、esponse G protein coupled receptors，ErGPCR)，經(jīng)過磷脂酶C以及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導(dǎo)USP的磷酸化，但是20E信號終止（脫敏）的機理尚不清楚。β-抑制蛋白1(β-arrestin1)是一類進化保守的參與GPCR脫敏的分子，在果蠅中，β-arrestin1(Kurtz)參與多種受體的脫敏，但β-arrestin1在昆蟲蛻皮激素信號中的脫敏機制仍然不清楚。

4、　　胰島素控制前胸腺(prothoracic glands，PGs)的生長決定蛻皮激素的釋放，并且蛻皮激素通過拮抗胰島素信號抑制細胞的生長。胰島素通過胰島素受體InR將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)，通過接頭蛋白Chico介導(dǎo)PI3K110磷酸化，并進一步磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又被稱作Akt)。磷酸化的Akt能進一步磷酸化叉頭框蛋白(Forkhead box，F(xiàn)oxO)，使其定位在細胞質(zhì)中，抑制凋亡的發(fā)生。在果蠅

5、研究中發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素抑制Akt的磷酸化，但具體分子機理還不清楚。
　　棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）屬鱗翅目夜蛾科，是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，且易于人工飼養(yǎng)，已經(jīng)逐漸成為研究昆蟲生長發(fā)育的重要實驗生物。本文以鱗翅目昆蟲棉鈴蟲作為研究材料，探索β-arrestin1在蛻皮激素信號脫敏中的功能及作用機制，對豐富動物甾醇類激素調(diào)控機理有重要的意義。胰島素作為昆蟲發(fā)育調(diào)控重要激素，探究Akt在蛻皮激素信號拮抗胰島素信號中的作用

6、，對進一步解棉鈴蟲發(fā)育的的分子機理，以及胰島素和蛻皮激素協(xié)同調(diào)控昆蟲發(fā)育的機理提供新的依據(jù)。
　　實驗結(jié)果及結(jié)論:
　　1.β-arrestin1參與蛻皮激素信號終止作用
　　利用免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)β-arrestin1在表皮、中腸、脂肪體的變態(tài)時期高表達，幼蟲中干擾β-arrestin1可導(dǎo)致提前化蛹以及嵌合蛹的形成，并且干擾和細胞系過表達實驗證明β-arrestin1可會降低20E應(yīng)答基因的表達。進一步的免疫細胞實驗

7、發(fā)現(xiàn)20E誘導(dǎo)β-arrestin1從細胞質(zhì)向細胞膜遷移，并與ErGPCR1相互作用，GPCR的抑制劑和PKC的抑制劑能夠抑制20E誘導(dǎo)的β-arrestin1的磷酸化以及向細胞膜的遷移。進一步的突變實驗發(fā)現(xiàn)，20E調(diào)控β-arrestin1在絲氨酸170和234位氨基酸的磷酸化和移位。這些結(jié)果表明，20E通過ErGPCR1-和PKC-信號誘導(dǎo)β-arrestin1磷酸化;磷酸化的β-arrestin1從細胞質(zhì)遷移到細胞膜與ErGPCR

8、1相互作用，以反饋調(diào)節(jié)的方式來阻斷20E信號。本文闡明20E信號終止的機制，豐富了動物類固醇激素非基因組信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　2.蛻皮激素通過抑制Akt磷酸化拮抗胰島素信號
　　從棉鈴蟲細胞系干擾Akt或高濃度的20E均能上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達，導(dǎo)致細胞凋亡。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，20E能夠抑制Akt-PH結(jié)構(gòu)域的向細胞膜的遷移并抑制Akt的磷酸化，為探宄上游的調(diào)控機理，檢測20E誘導(dǎo)后PTEN(phosphatase and

9、 tensin homolog deleted on chromosome ten，一種磷酸酯酶)的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN能受20E誘導(dǎo)上調(diào)表達，并且干擾PTEN能解除20E對Akt磷酸化和細胞膜遷移的抑制。干擾轉(zhuǎn)錄因子EcRB1和USP1能抑制20E誘導(dǎo)的PTEN的表達。這些結(jié)果表明，蛻皮激素通過EcRB1和USP1上調(diào)PTEN的表達抑制Akt的磷酸化，從而上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達導(dǎo)致細胞凋亡，此研究闡明20E信號拮抗胰島素信號的具體分