五齡柞蠶后部絲腺差異表達(dá)蛋白研究.pdf

1、柞蠶是一種典型的野蠶，其絲腺能夠合成和分泌絲蛋白。在五齡期，柞蠶幼蟲大量合成和分泌絲素蛋白，后部絲腺的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和新陳代謝也發(fā)生了很大的變化。為研究差異表達(dá)蛋白在絲素蛋白準(zhǔn)備和合成過程中所起的作用，本文通過雙向電泳和質(zhì)譜的方法分離和鑒定了五齡柞蠶幼蟲絲腺中表達(dá)量上調(diào)的蛋白，并通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測了其中兩個(gè)蛋白的RNA表達(dá)變化。 ⑴為得到較高分辨率的蛋白電泳圖譜，實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化，選用兩步提取法提取柞蠶絲腺組織蛋白，將水溶性蛋白和微

2、溶或不溶的蛋白分開，防止高豐度蛋白對雙向電泳的影響；并用2Dclean-up試劑盒對蛋白溶液進(jìn)行了預(yù)處理，減少了橫條紋。 ⑵實(shí)驗(yàn)采用載體兩性電解質(zhì)進(jìn)行等點(diǎn)聚焦，建立了一套簡單經(jīng)濟(jì)的雙向電泳方法，并對柞蠶絲腺蛋白雙向電泳的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到此系統(tǒng)的最佳上樣量為：30μg；最佳pH范圍：pH4～7；最佳聚焦條件：1000V，3h。通過和五齡一天柞蠶絲腺蛋白的雙向電泳圖譜相比較發(fā)現(xiàn)：在五齡四天時(shí)蛋白表達(dá)有較大的差異。 ⑶采用

3、IPG固化膠條進(jìn)行雙向電泳，得到了分辨率較高的五齡一天和四天柞蠶絲腺蛋白雙向電泳圖譜，每張圖譜檢測到大約350個(gè)蛋白點(diǎn)。通過Imagemaster軟件進(jìn)行比對分析，選取了23個(gè)在五齡四天特異表達(dá)或表達(dá)量上調(diào)兩倍以上的蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，得到了7個(gè)已知蛋白，這些蛋白在轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞新陳代謝中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)對其中的兩個(gè)蛋白基因(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和核糖體蛋白L8)進(jìn)行了克隆，獲得了Genbank登錄號為EU54149