柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白2的表達與分子特性的研究.pdf

1、昆蟲滯育關(guān)聯(lián)蛋白(DAP)是在研究昆蟲滯育過程中發(fā)現(xiàn)的一類與昆蟲滯育的發(fā)生和維持有關(guān)的蛋白。目前為止，關(guān)于昆蟲DAP的研究甚少，對其分子特性及其如何參與滯育過程尚不清楚。
　　本研究從NCBI獲取柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白基因2（diapause-associatedprotein2，dap2）的序列，GenBank登錄號為JQ003184.1。比對分析發(fā)現(xiàn)，DAP2與煙草天蛾和家蠶眼色素結(jié)合蛋白(OBP)同源性可達到56％和57％，推測其

2、可能是一種OBP。信號肽和亞細胞定位預測結(jié)果表明，DAP2可能有信號肽，為分泌型蛋白，這與其攜帶和轉(zhuǎn)運色素功能相符。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預測其內(nèi)部可能形成一個眼色素結(jié)合位點。
　　液氮研磨柞蠶蛹脂肪體組織，利用TRIzolReagent提取RNA，利用RT-PCR擴增得到dap2基因片段（去掉預測信號肽的序列）的并克隆到原核表達載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-dap2，在E.coliBL21(DE3)誘

3、導表達重組DAP2。經(jīng)SDS-PAGE分析有一大小30kD特異性蛋白條帶表達，與預期值相符，經(jīng)質(zhì)譜鑒定正確。進一步利用鎳柱親和層析純化該蛋白，并免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，Westernblot檢測抗體特異性較高。
　　繼而利用熒光定量PCR及Westernblot檢測柞蠶各發(fā)育時期及各組織的dap2基因的轉(zhuǎn)錄和表達情況。結(jié)果表明，滯育期dap2基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平最高，其次是在非滯育蛹期和五齡幼蟲中，這與DAP與滯育過程相關(guān)

4、相吻合。五齡幼蟲脂肪體中dap2基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，血淋巴中DAP2表達水平最高，這提示DAP2可能在脂肪體中合成后分泌到血淋巴中。
　　為了進一步闡明DAP2的分子特性，本研究從非滯育蛹血淋巴中分離純化到純度約94％的DAP2蛋白。全波長掃描測定發(fā)現(xiàn)其在可見光范圍內(nèi)不存在特異的吸收峰，PNGaseF特異性地切割N-糖鏈，DAP2分子量減少2kD左右，表明該蛋白為糖蛋白。雙向電泳并結(jié)合質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明純化后的蛋白存在三個不同的點，