羊口瘡病毒蛋白086的蛋白水解分子特性研究.pdf

1、羊傳染性膿皰病(Orf)，俗稱羊口瘡，是由羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)感染引起的一種急性接觸性傳染病。主要感染山羊和綿羊，典型特征為患羊口鼻等處粘膜和皮膚形成紅斑、潰瘍、丘疹、膿瘡和疣狀厚痂。本病常呈群發(fā)性流行，最易感染3～6月齡的羔羊。目前，該病在美洲、歐洲、非洲等一些主要養(yǎng)羊國家廣為分布，嚴重威脅著世界養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類的健康，是羊的主要疫病之一。在我國東北、西北、西南等地區(qū)的吉林、黑龍江、青海、新疆、內(nèi)蒙等省，Orf

2、也均有不同程度的爆發(fā)，其中一些地區(qū)非常嚴重，制約了我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。該病毒的抵抗力強，羊群一旦被感染則很難清除且可持續(xù)危害羊群多年，給畜牧業(yè)造成一定的危害。
　　羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)屬痘病毒科副痘病毒屬，是該屬的代表種。是已知的病毒顆粒體積較大的雙鏈DNA病毒。電鏡下，該病毒呈磚形或卵圓形，病毒表面呈繩索樣縱橫交錯排列結(jié)構(gòu)。且病毒顆粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有核心、側(cè)體和包膜。病毒基因組全長大約138kb，GC含量高達64

3、％，推測其含有132個基因?；蚪M兩端的基因(ORF001-008，ORF112-134)變異較大，編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白;而在基因組中部的基因（ORF009-ORFV111）則很保守，對病毒復(fù)制、裝配和形態(tài)發(fā)生過程起關(guān)鍵作用。目前關(guān)于ORFV病毒的復(fù)制、裝配、形態(tài)發(fā)生及免疫機制的研究較少。
　　我們實驗室的前期研究已獲得了一株單克隆抗體5F2D8，經(jīng)免疫沉淀及質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)該抗體能夠特異性識別ORFV086蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，O

4、RFV086基因位于病毒基因組的中間區(qū)域，為高度保守的基因，推測其在病毒的復(fù)制、裝配和形態(tài)發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。
　　對不同的ORFV病毒株分析顯示，ORFV086基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白表達在細胞內(nèi)病毒粒子核心，并且該蛋白與痘苗病毒P4a蛋白及其他痘病毒同系物結(jié)構(gòu)相似。在痘苗病毒中，P4a蛋白大約占病毒粒子干重的14％，為病毒含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白。其由A10L基因編碼，在病毒感染晚期形成，大小約102kDa，之后在GGA和GGS位點發(fā)

5、生蛋白水解形成大小分別為62kDa、23kDa、9kDa的三個片段。這一蛋白水解過程對痘苗病毒子代粒子的裝配，形態(tài)發(fā)生和成熟有著重要的作用。且核心蛋白形態(tài)發(fā)生的蛋白水解只發(fā)生在未成熟病毒(Ⅳ)向細胞內(nèi)成熟病毒(IMV)的轉(zhuǎn)變過程中，使得球形的Ⅳ變?yōu)榇u形的IMV。目前認為，在感染性病毒粒子裝配過程中，核心蛋白的水解加工是病毒成熟過程中的一種普遍現(xiàn)象。對于痘苗病毒(vaccinia virus，VV)，核心蛋白發(fā)生蛋白水解的特點是:(1)含

6、有一個AGX模體;(2)在該病毒感染晚期表達;(3)包裝入裝配的病毒粒子，組成病毒粒子核心。負責(zé)病毒蛋白水解加工的蛋白酶通常由病毒自身編碼。其他DNA病毒，例如腺病毒和非洲豬瘟病毒的復(fù)制及形態(tài)發(fā)生過程中，病毒核心蛋白也發(fā)生了特異性蛋白水解。與VV病毒核心蛋白發(fā)生水解的AGX膜體不同，腺病毒核心蛋白發(fā)生水解的位點是Gly-Gly-X膜體。同樣地，非洲豬瘟病毒的三個核心蛋白也是在Gly-Gly-X膜體發(fā)生蛋白水解。病毒核心蛋白發(fā)生蛋白水解已

7、經(jīng)成為許多DNA病毒和RNA病毒復(fù)制周期中的一種普遍現(xiàn)象。
　　NA1/11株的ORFV086基因全長2718bp，編碼的ORFV086蛋白大小為100.05 kDa。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ORFV086蛋白與痘苗病毒P4a蛋白及其他痘病毒同系物結(jié)構(gòu)相似。ORFV086蛋白是否具有類似于VV P4a蛋白的蛋白水解現(xiàn)象？目前還沒有文獻報道。本研究的目的是鑒定ORFV086蛋白的水解位點及其蛋白水解的分子特性，為了解ORFV的復(fù)制、裝配

8、、形態(tài)發(fā)生及成熟過程奠定基礎(chǔ)。
　　通過基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建并原核表達了重組的ORFV086全長蛋白，免疫兔子制備ORFV086多克隆抗體。該多克隆抗體能應(yīng)用于ORFV086蛋白的檢測，從而為ORFV086蛋白的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　通過氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析，預(yù)測ORFV086蛋白可能的水解位點。結(jié)果顯示，ORFV086為一個高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白，與P4a蛋白的AGS及AGT水解位點不同，其預(yù)測的蛋白水解位點為

9、GGA，GGS。對ORFV086全長蛋白的氨基酸序列進行AGX膜體檢索，發(fā)現(xiàn)AGP，AGK及AGL均是AGX膜體，這五個位點都有可能是ORFV086蛋白的水解位點。根據(jù)所預(yù)測水解位點位置，通過基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了含ORFV086全長或不同大小ORFV086片段的12個重組質(zhì)粒。
　　為確定ORFV086蛋白水解位點的位置，將N端或C端帶有flag標簽的12個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染OFTU細胞，加入NA1/11病毒進行水解實驗，通過Fl

10、ag抗體以及ORFV086多克隆抗體檢測ORFV086蛋白的水解條帶。經(jīng)Flag抗體分析發(fā)現(xiàn)，在加入ORFV后，2B-086，2B-N-GGS以及2B-N-GGA均可以檢測到兩條大小分別為45kDa,25kDa的特異性條帶，因其是N端帶有flag標簽，可推測其水解位點均位于N-GGA之間。然而，2B-GGA-C以及2B-GGS-C均沒有檢測到除目的條帶以外的其他水解條帶。進一步的ORFV086多克隆抗體分析發(fā)現(xiàn)，加入 ORFV后，2B-

11、086,2B-N-GGS,2B-N-GGA,2B-GGA-C,2B-GGS-C，2B-GGA-GGS均可以檢測到5條大小分別為100kDa，33kDa，30kDa，25kDa以及21kDa的條帶。有趣的是，2B-GGS-C加入ORFV后還能特異性識別一條大小約23kDa條帶，且該23kDa條帶的大小與位置都與2B-GGS-C重組蛋白一致，這表明該23kDa條帶很有可能就是2B-GGS-C。
　　C端帶有flag標簽的重組質(zhì)粒經(jīng)Fl

12、ag抗體分析，加入ORFV后，4A-086及4A-GGA-C檢測到一條約23kDa的特異性條帶，推測該23kDa條帶是在GGS位點水解形成的4A-GGS-C。4A-N-GGS和4A-N-GGA加入ORFV后檢測到一條45kDa特異性條帶，推測該45kDa條帶的水解位點位于N-GGA之間。4A-GGS-C沒有看到除目的條帶以外的其他水解片段。進一步ORFV086多克隆抗體分析發(fā)現(xiàn)，加入 ORFV后，4A-086，4A-N-GGS，4A-N

13、-GGA，4A-GGA-C，4A-GGS-C，4A-GGA-GGS均可以檢測到5條大小分別為100kDa，33kDa，30kDa,25kDa以及21kDa的條帶。有趣的是，4A-086，4A-GGA-C及4A-GGS-C在加入ORFV后，用ORFV086多克隆抗體能特異性識別一條23kDa條帶，并且該23kDa條帶大小與位置都與4A-GGS-C重組蛋白一致。這表明該23kDa條帶很有可能就是4A-GGS-C。4A-GGS-C+ORFV中

14、的23kDa條帶是真核表達的重組蛋白4A-GGS-C。然而，4A-086+ORFV和4A-GGA-C+ORFV分別轉(zhuǎn)染的是4A-086和4A-GGA-C重組質(zhì)粒，重組蛋白應(yīng)該分別只有4A-086和4A-GGA-C，那么在加入ORFV后，4A-086和4A-GGA-C出現(xiàn)的23kDa條帶就很有可能是在GGS位點水解形成的4A-GGS-C片段，并且這與用flag抗體檢測的結(jié)果是一致的。以上結(jié)果表明ORFV086在GGS位點發(fā)生了水解作用。<

15、br>　　為進一步確定23kDa條帶的水解位點，我們分別將4A-086全長中的AGP,AGK，AGL，GGA和GGS位點突變?yōu)镮DI。構(gòu)建的突變體分別轉(zhuǎn)染OFTu細胞，比較加入ORFV組與未加ORFV組的條帶差異。經(jīng)Flag抗體和ORFV086多克隆抗體分析發(fā)現(xiàn)，加入ORFV病毒后，除將GGS位點突變?yōu)镮DI的突變質(zhì)粒4A-GGS-IDI沒有檢測到23kDa的條帶外，其他突變體和4A-086均能檢測到該23kDa條帶。這說明23kDa條

16、帶是ORFV086在GGS位點進行蛋白水解后形成的產(chǎn)物4A-GGS-C。以上結(jié)果進一步表明ORFV086在GGS位點發(fā)生了蛋白水解作用。
　　進一步對ORFV086蛋白進行非放射性pulse-chase分析，結(jié)果顯示，21kDa條帶為ORFV086蛋白的一個水解產(chǎn)物;23kDa條帶為4A-086蛋白的一個水解產(chǎn)物。這也進一步證實4A-086在GGS位點發(fā)生了蛋白水解，水解形成產(chǎn)物4A-GGS-C大小為23kDa。值得注意的是，在c

17、hase標記蛋白中，還可以檢測到ORFV086全長和4A-086全長蛋白，這表明ORFV086蛋白或者4A-086蛋白均沒有完全發(fā)生蛋白水解，也即只有一部分的全長蛋白發(fā)生蛋白水解。這與前面推測ORFV086全長及其21kDa水解蛋白都是組成ORFV成熟病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白是相符的。
　　通過以上研究，對ORFV086蛋白水解的特性進行了鑒定。ORFV086基因為晚期表達基因。ORFV086蛋白在GGS位點處進行了不完全水解，形成產(chǎn)物