羊口瘡病毒感染宿主細胞的蛋白質(zhì)組變化及功能分析.pdf

1、羊傳染性膿皰(contagiousecthyma)俗稱“羊口瘡”，是由痘病毒科，副痘病毒屬羊口瘡病毒（orfvirus，ORFV）引起的一種急性、高度接觸性人獸共患傳染病。該病主要侵害綿羊和山羊。臨床上患病動物以口唇周圍和乳房部位皮膚形成丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征。該病發(fā)病率高，病死率低。羊傳染性膿皰的暴發(fā)和流行不但嚴重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人們的身體健康。
　　隨著基因組測序技術的發(fā)展，多株羊口瘡病毒的全基因組序

2、列被測定，這為羊口瘡病毒致病的分子機制研究提供了參考，但是基因組學技術研究只針對病原體自身，而不能反映病原體與宿主間的相互作用。目前利用蛋白質(zhì)組學技術對ORFV和宿主細胞相互作用的研究未見相關報道。本研究以ORFV和山羊皮膚成纖維細胞(goat skin fibroblasts，GSFs)為研究對象，應用同位素標記相對和絕對定量聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(two-dimensionalliquidchromatography-tand

3、emmassspectrometrycoupledwithisobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ-2D-LC-MS/MS)對ORFV感染GSFs后的蛋白組學變化，進行了探索研究和功能分析，期望能為人們了解羊口瘡病毒與宿主細胞的相互作用研究提供參考信息，具體研究內(nèi)容如下:
　　1.羊口瘡病毒囊膜蛋白(B2L)單克隆抗體(MonoclonaiAntibodies，M

4、cAb)的制備
　　參照GenBank上公布的ORFVB2L基因序列(GU320351)設計引物，應用PCR方法獲得ORFVB2L基因全長，并將其定向連接到原核表達載體pET-30a上，在此基礎上進行蛋白表達和純化。以純化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，并利用雜交瘤技術將免疫脾細胞和SP2/0細胞進行細胞融合，經(jīng)過4次篩選和克隆，獲得4株穩(wěn)定分泌抗ORFVB2L蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為D1-B3，E4-C6，3-A1

5、1-2，B1-F3-A3。單抗亞類鑒定結果表明4株單抗的亞類均為IgG1，Western-blot和間接免疫熒光試驗結果表明4株單抗均能與羊口瘡病毒發(fā)生特異性反應。
　　2.羊口瘡病毒在GSFs上的適應性和增殖特性研究
　　將從患病羊痂皮病料中分離出的ORFV在GSFs上進行適應性培養(yǎng)，以探討病毒在該細胞上的增殖特性。對GSFs首次接種ORFV后進行細胞病變觀察和間接免疫熒光檢測(indirectimmunofluoresc

6、entassay，IFA)。結果顯示ORFV首次感染GSFs24h后開始有少量細胞出現(xiàn)腫脹和變圓，60h細胞開始脫落，72h病變完全。IFA結果顯示接種ORFV的GSFs有特異性綠色熒光，表明ORFV能在GSFs內(nèi)復制增殖。收集ORFV首次感染GSFs后不同時間點的病毒液進行病毒基因組拷貝數(shù)的Real-timePCR檢測和TCID50測定，Real-timePCR檢測結果顯示感染后9h即可檢測到病毒DNA，隨感染時間延長病毒基因組拷貝數(shù)

7、快速上升，72h達到最大(5.52×106copy/uL)。TCID50測定結果與病毒基因組拷貝數(shù)的增長趨勢基本一致。
　　在此基礎上，將ORFV在GSFs上連續(xù)傳至15代使其適應該細胞。結果顯示隨著傳代次數(shù)的增多，細胞開始出現(xiàn)病變時間逐漸縮短，至10代后病變穩(wěn)定。以第15代GSFs適應毒(CHINALuoyang2013)感染GSFs，感染后不同時間分別收集感染細胞和培養(yǎng)上清，利用Real-timePCR對不同樣品的病毒DNA進

8、行定量分析，繪制ORFV在GSFs上的一步法生長曲線。結果顯示:感染后3h～35h，細胞內(nèi)病毒DNA含量隨感染時間延長而增加，之后因細胞裂解病毒DNA含量逐漸降低;細胞外病毒DNA含量呈“S型”曲線增長，感染后0h～11h為潛伏期，病毒含量維持在較低水平，第11h～43h為突破期，病毒DNA含量迅速增加，感染后43h～51h增長速度減慢，逐步進入穩(wěn)定期。
　　3.羊口瘡病毒的遺傳進化分析和ORF125蛋白的亞細胞定位
　　利

9、用DNAstar和MEGA4.0對ORFVGSFs適應毒株CHINALuoyang2013進行基于B2L基因的遺傳進化分析，結果表明CHINALuoyang2013與2012中國疫苗株(JQ904789)同源性最高，處于同一進化分支。
　　利用DNAstar和在線ExPASy工具對ORFVORF125蛋白與Bcl-2蛋白家族成員的氨基酸序列和二級結構進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn)ORF125與Bcl-2家族蛋白一級結構同源性很低，但兩者二

10、級結構中α-螺旋位置和數(shù)量相似，推測它們也有著相似的三級結構，可能具備相同的功能。參考ORFVNZ2的ORF125基因序列(DQ184476)設計引物，利用常規(guī)分子克隆方法構建綠色熒光重組表達載體pEGFP-ORF125，瞬時轉(zhuǎn)染GSFs后觀察ORF125在GSFs中的定位情況，結果顯示ORFV125蛋白主要在胞質(zhì)中表達，在細胞核中僅有少量分布。
　　4.羊口瘡病毒感染宿主細胞的蛋白質(zhì)組變化及功能分析
　　以GSFs首次接種

11、ORFV為感染模型，利用iTRAQ-2D-LC-MS/MS技術研究病毒感染細胞的全細胞蛋白質(zhì)組表達變化。分別提取病毒感染53h后感染細胞和正常細胞的總蛋白，依次經(jīng)烷基化，還原，酶解處理，iTRAQ標記和混合等過程，最后經(jīng)液相色譜分離后再經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。質(zhì)譜分析結果表明共鑒定到2776個蛋白，有282個蛋白發(fā)生差異表達，其中上調(diào)表達蛋白222個，下調(diào)表達蛋白60個。
　　利用基因本體(GeneOntology，GO)數(shù)據(jù)庫對這些

12、差異表達蛋白進行GO注釋和分類，結果發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白幾乎均勻處于細胞的所有組分中，主要參與細胞形態(tài)發(fā)生，蛋白合成，新陳代謝，免疫監(jiān)視，外界刺激反應等過程;差異表達蛋白的分子功能包括結合、催化、分子轉(zhuǎn)導、結構分子和酶調(diào)節(jié)等活性。蛋白相鄰類的聚簇(ClusterofOrthologousGroups，COG)注釋分類結果表明這些差異表達蛋白主要涉及翻譯后修飾，蛋白折疊，分子伴侶，核糖體結構與生物合成，能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換，信號轉(zhuǎn)導等功能。利用KE

13、GG數(shù)據(jù)庫對這些差異蛋白進行Pathway顯著性富集分析，結果表明差異表達蛋白主要參與蛋白酶體，剪接體，糖酵解和糖新生途徑，磷酸戊糖途徑，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activativedreceptors，PPAR)信號通路，NF-kappaB信號通路，雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信號通路，β-TGF信號通路，內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣吸收

14、途徑，抗原呈遞途徑，天然殺傷性細胞介導的細胞毒性作用途徑，細胞內(nèi)吞途徑等。
　　5.HSPA1B蛋白的亞細胞定位及其對ORFV增殖的影響
　　選取差異表達蛋白HSPA1B構建綠色熒光重組表達載體pEGFP-HSPA1B，轉(zhuǎn)染細胞后觀察HSPA1B在GSFs中的亞細胞定位情況，結果顯示HSPA1B蛋白彌散地分布在胞質(zhì)中。在GSFs上過表達HSPA1B，然后用ORFV感染該細胞，并利用Real-timePCR檢測病毒的增殖，分析