鴨乙肝病毒感染鴨原代肝細胞差異蛋白質(zhì)組的研究及DMSO維持鴨原代肝細胞易感性差異膜蛋白組的初步研究.pdf

1、乙型肝炎是嚴重危害人類健康的傳染病，中國有近1.2億人感染，其致病原乙肝病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科。HBV感染具有嚴格宿主、器官特異性，目前缺乏理想的HBV自然感染細胞和動物研究系統(tǒng)，對HBV病毒感染過程特別是早期感染過程機制仍然了解很少，與感染過程相關(guān)的細胞蛋白以及病毒感染對宿主細胞的蛋白表達及功能的影響同樣缺乏研究。與HBV具有相似的病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)以及復(fù)制特點的鴨乙肝病毒(DHBV)，同屬嗜肝DNA病毒；DHBV-鴨原代

2、肝細胞(PDHs)模型能夠獲得很高感染效率，并可持續(xù)釋放具感染性病毒顆粒，一直是研究嗜肝病毒的重要細胞和動物模型。
　　基于二維電泳(2-DE)和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(MS/MS)的蛋白組學(xué)方法在當今生命科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，既可以研究病毒顆粒上的宿主蛋白，又可研究病毒感染細胞感染前后的細胞差異蛋白組，同樣可以研究病毒蛋白對細胞蛋白表達的影響，其高通量的數(shù)據(jù)為研究病毒與宿主相互作用及病毒感染機制打下基礎(chǔ)。鴨是禽流感病毒及鴨乙肝病毒的重要宿主

3、，但目前基因組數(shù)據(jù)缺乏；但雞全基因組的測定和質(zhì)譜技術(shù)特別是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為鑒定鴨蛋白打下基礎(chǔ)。全蛋白組可以整體研究蛋白組分變化情況；組分蛋白組(如親水性蛋白和疏水性蛋白)可使2-DE能夠分析一些低豐度的宿主蛋白。鴨原代細胞在5％的血清培養(yǎng)基里會逐漸丟失對DHBV的易感性，但含1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基可維持其對DHBV的易感性，目前鴨原代肝細胞在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)易感性改變機制未知。
　　本課題擬采用鴨乙肝病毒-鴨原代肝細胞(D

4、HBV-PDHs)感染細胞模型，運用基于2-DE及MS/MS的方法研究：(1)DHBV感染鴨肝細胞后蛋白表達改變情況，研究DHBV病毒感染相關(guān)蛋白；(2)鴨原代肝細胞在5％血清培養(yǎng)基與在1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的差異組分蛋白組(親水性蛋白組分和疏水性蛋白組分即膜蛋白)，研究可能與DHBV易感性相關(guān)的宿主蛋白。并利用生物信息學(xué)的方法對差異蛋白組的數(shù)據(jù)進行功能分類以及通路分析，分析差異蛋白在病毒感染過程中的作用。
　　DHBV

5、感染鴨原代肝細胞的差異蛋白組顯示，DHBV感染后24、72以及120小時的鴨原代肝細胞與未感染病毒鴨原代肝細胞的差異表達蛋白共有75個差異蛋白點(蛋白表達變化1.5倍以上)，其中質(zhì)譜鑒定成功51個蛋白點，對應(yīng)42個差異蛋白蛋白。差異蛋白主要涉及碳水化合物代謝、細胞骨架、氨基酸代謝、應(yīng)激反應(yīng)等；通路分析顯示，在碳水化合物代謝差異蛋白中，GAPDH處于蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中心地位，HNF4alpha處于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中心位置，在細胞骨架差異蛋白中，b

6、eta-actin以及vinculin處于蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中心位置。對差異蛋白功能分析顯示，DHBV感染鴨原代肝細胞以后致細胞碳水化合物代謝和細胞骨架紊亂，可能利于病毒的復(fù)制和包裝；使谷氨酰胺代謝增強，可能為病毒感染提供替代能量來源；病毒感染可導(dǎo)致細胞應(yīng)激反應(yīng)包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)；并對一些特定差異蛋白如Elongation Factor2在病毒感染過程中的作用進行了討論。對差異蛋白annexin A2和beta-actin的差異

7、表達情況同時進行了蛋白免疫印記驗證。
　　為尋找影響DHBV的易感性的宿主蛋白特別是相關(guān)膜蛋白，利用2-DE分析了鴨原代肝細胞、在1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)8天的鴨原代肝細胞、在5％FBS培養(yǎng)基里培養(yǎng)8天的鴨原代肝細胞的組分蛋白組(親水性蛋白組分和疏水性蛋白組分即膜蛋白)。組分蛋白基于Trinton X-114對親疏水性蛋白在溫度變化的情況下溶解度不同原理。目前已完成2-DE預(yù)實驗，為正式實驗做好準備。
　　綜上所述，

8、本課題首次采用2-DE及串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析了DHBV感染鴨原代肝細胞在感染后的差異蛋白質(zhì)組，成功鑒定51個蛋白點、對應(yīng)為42種蛋白質(zhì)。差異蛋白功能分析顯示，DHBV感染致肝細胞碳水化合物及細胞骨架紊亂，使氨基酸代謝增強，并引起細胞應(yīng)激(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化還原應(yīng)激)，特定蛋白功能分析顯示DHBV可能通過細胞Elongation Factor影響宿主蛋白的合成。DMSO影響鴨原代肝細胞對DHBV的膜蛋白組已完成預(yù)實驗，證實膜蛋白組分析鴨原