鴨胚原代肝細胞抗乙肝模型的建立及應用.pdf

1、乙型肝炎是一種世界范圍內(nèi)流行的嚴重傳染病,目前尚無根治的特效藥物和方法。由于乙肝病毒(HBV)宿主范圍窄,建立細胞及動物模型比較困難,大大限制了抗HBV藥物的發(fā)展。因此,建立一種簡便、有效的乙肝模型對于深入研究肝炎的發(fā)病機制和開發(fā)新型抗乙肝藥物具有重要意義。
　　本課題以紹興麻鴨受精卵孵化的感染鴨胚為原材料,探索了鴨胚肝細胞的分離及原代培養(yǎng)技術(shù),建立了基于鴨胚原代肝細胞的鴨乙肝病毒(DHBV)DNA的熒光定量PCR檢測方法,并利用

2、建立的鴨胚原代肝細胞模型研究了幾種天然提取物的抗乙肝活性,從而驗證了該模型的特異性、靈敏性和可行性。
　　1.鴨胚肝細胞的分離及原代培養(yǎng)采用紹興麻鴨受精卵孵化的鴨胚作為材料,首先利用普通PCR技術(shù)篩選出先天感染陽性鴨胚,然后以先天陽性鴨胚為基礎進行細胞模型的構(gòu)建。具體是通過以下幾方面條件的優(yōu)化:(1)鴨胚胚齡的選擇:選擇15、16、17、18、19、20、21、22、23、24日的鴨胚進行比較,結(jié)果表明18-22日齡的鴨胚效果較好

3、;(2)胰酶消化液濃度及時間的選擇:選擇濃度為0.15％,0.25%,0.35%,消化時間分別為5min、10min、15min進行比較,結(jié)果表明濃度為0.25%的胰酶濃度,消化時間10min時,效果最佳;(3)離心轉(zhuǎn)速大小的選擇:選擇1000r、3000r、5000r、7000r的轉(zhuǎn)速進行比較,結(jié)果表明3000r或5000r效果較好;(4)胎牛血清的濃度選擇:選擇胎牛血清的濃度為5%、10%、15%、20%進行比較,結(jié)果表明血清濃度為

4、10%時即可滿足原代細胞培養(yǎng)需要;(5)進口血清和國產(chǎn)血清的選擇:選擇GIBCOTM的血清與國產(chǎn)四季青血清進行對比,在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h分別進行觀察,結(jié)果表明國產(chǎn)血清與進口血清的生長情況沒有大的差別,出于經(jīng)濟考慮選擇國產(chǎn)血清;(6)冰浴時間的選擇:分別選擇5min、10min、15min、20min、25min的冰浴時間,結(jié)果表明冰浴時間選擇15min或20min,細胞生長情況較好;(7)培養(yǎng)基的選擇:選擇RP

5、MI Medium1640和DMEM兩種培養(yǎng)基進行對比,結(jié)果表明兩種培養(yǎng)基在進行原代培養(yǎng)時差別不大;(8)生長因子的選擇:選擇胰島素和氫化可的松琥珀酸氫鈉兩種生長因子分別進行添加和共同添加,結(jié)果表明在兩種生長因子共同添加的時候效果最好;(9)細胞接種密度的選擇:選擇2×105copies.mL-1,4×105copies.mL-1,6×105copies.mL-1,8×105copies.mL-1,10×105copies.mL-1五種

6、密度進行比較,結(jié)果表明(4-8)×105copies.mL-1的密度時細胞生長較好。
　　通過對鴨胚肝細胞分離和原代培養(yǎng)條件的摸索和優(yōu)化,確立了鴨胚肝細胞的原代培養(yǎng)方法和最優(yōu)參數(shù),為抗乙肝藥物評價模型的建立打下了基礎。
　　2.鴨胚肝細胞中鴨乙肝病毒DNA定量檢測方法的建立為了建立準確、快速、特異的DHBV-DNA SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法,我們采用了一對跨越DHBV基因組正負兩鏈的特異性引物,并且將DH

7、BV基因組擴增產(chǎn)物克隆到了PMD-18T載體上,然后以該重組質(zhì)粒為模板進行梯度稀釋,構(gòu)建標準曲線,進行了特異性、靈敏性、重復性分析。結(jié)果表明,建立的方法可以特異性定量檢測DHBV-DNA,在1.0×102-1.0×108 copies·μL-1范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系,擴增效率為103.8%,相關(guān)系數(shù)r2為0.995,靈敏度為1.0×102copies·μL-1,重復性檢驗差異最大系數(shù)為3.03%。因此,建立的熒光定量PCR檢測方法具有

8、特異性、靈敏性、準確性等優(yōu)點,完全可以用于DHBV-DNA的定量檢測和抗乙肝病毒藥物的篩選與評價。
　　3.基于鴨胚肝細胞模型的天然產(chǎn)物抗乙肝活性評價采用已建立的基于鴨胚原代肝細胞的抗乙肝藥物評價模型,以拉米夫定作為陽性對照藥物,研究3種天然提取物對DHBV-DNA復制的影響,以驗證模型的可靠性。結(jié)果表明:(1)蒲公英提取物處理鴨胚肝細胞后,對感染肝細胞DHBV-DNA復制具有不同程度抑制作用,且隨著時間延長,抑制作用逐漸增強。在

9、作用3天后,50-100μg/ml劑量對DHBV-DNA具有顯著抑制作用(P<0.01),在作用6天后,1-100μg/ml劑量對DHBV-DNA均有顯著抑制作用(P<0.01),且100μg/ml劑量的抑制作用優(yōu)于藥物拉米夫定。(2)菊苣酸作用鴨胚肝細胞3天后,25-100μg/ml劑量顯著降低了DHBV-DNA水平(P<0.01),在作用6天后,1-100μg/ml劑量顯著降低了DHBV-DNA水平(P<0.01)。(3)齊墩果酸作

10、用鴨胚肝細胞3天后,10-100μg/ml劑量顯著抑制了DHBV-DNA復制(P<0.01),在作用6天后,1-100μg/ml劑量顯著抑制了DHBV-DNA復制(P<0.01)。
　　總之,本論文以鴨胚原代肝細胞為基礎,研究了鴨胚肝細胞中DHBV-DNA的熒光定量PCR檢測方法,建立了一種基于鴨胚原代肝細胞的抗乙肝藥物評價模型,并運用此模型開展了幾種天然產(chǎn)物的抗乙肝作用研究。該模型的建立為今后深入研究乙肝的發(fā)病機制和篩選新型抗乙