內(nèi)分泌干擾化學物中華大蟾蜍原代肝細胞篩選模型的研究.pdf

1、目的:該研究選用雄性中華大蟾蜍作為試驗動物,利用RT-PCR技術(shù)進行雌激素依賴性基因-卵黃蛋白原(VTG)編碼基因的篩選,在此基礎(chǔ)上研究該基因表達與雌激素、類雌激素的劑量依賴性關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系,以建立一種中華大蟾蜍原代肝細胞模型,為內(nèi)分泌干擾作用機理的研究和環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的篩選提供一種快速、靈敏、可靠的方法.方法:選取2-3歲齡、體重60-70g的成年雄性中華大蟾蜍,乙醚麻醉,背側(cè)淋巴囊注射3 000U肝素,在室溫下心室插管進行

2、肝臟原位灌注,0.5﹪胰蛋白酶和0.01﹪EDTA混合消化,分離培養(yǎng)肝細胞,靜置4小時待細胞完全沉降后進行染毒.收集不同染毒條件下的中華大蟾蜍原代肝細胞各10<'6>個,提取總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),檢測目的基因的表達:Ⅰ.中華大蟾蜍雌激素依賴性基因的篩選Ⅱ.目的基因測序和同源性分析;Ⅲ.雌二醇(E2)與目的基因mRNA表達的時間-效應(yīng)關(guān)系的研究;Ⅳ.雌二醇(E2)與目的基因mRNA表達的劑量依賴性關(guān)系的研究;