高通量篩選評(píng)價(jià)典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物細(xì)胞毒性及其雌激素效應(yīng).pdf

1、隨著人類工業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn),大量化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中不合理釋放,目前,全球已知的化學(xué)品有700萬之多,進(jìn)入環(huán)境并日常接觸使用的已達(dá)數(shù)十萬余種,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)多種化合物屬于內(nèi)分泌干擾物。這些化學(xué)品進(jìn)入環(huán)境后,可模擬或抑制內(nèi)源性激素的生物效應(yīng),改變信號(hào)傳遞過程,干擾內(nèi)源性激素的產(chǎn)生從而造成內(nèi)分泌功能紊亂。近年來,有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究己越來越受到各國的廣泛關(guān)注。發(fā)達(dá)國家以巨大的投入在研究環(huán)境激素的種類、污染途徑、主要污染源、生態(tài)危害、分子

2、作用機(jī)理、污染控制和防治對(duì)策方面進(jìn)行了大量的工作。美國EPA和NIH于1998年8月開始實(shí)施內(nèi)分泌干擾物篩選計(jì)劃,日本環(huán)境廳發(fā)表“環(huán)境類激素戰(zhàn)略規(guī)劃公告”,于1999年正式啟動(dòng)了環(huán)境類激素篩選計(jì)劃。歐洲各國普遍建立政府行為的研究中心,實(shí)施環(huán)境激素的研究計(jì)劃。據(jù)估計(jì),發(fā)達(dá)國家在環(huán)境激素的研究方面已經(jīng)投入了數(shù)十億美元?？墒怯捎谠u(píng)價(jià)體系復(fù)雜,試驗(yàn)周期長,且花費(fèi)巨大,還有相當(dāng)一部分化合物缺少必要的環(huán)境行為和毒理學(xué)數(shù)據(jù),因此建立高通量篩選評(píng)價(jià)潛在

3、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物毒理學(xué)效應(yīng)的方法已是現(xiàn)階段當(dāng)務(wù)之急。
　　 在本研究中,我們進(jìn)行了三方面的工作。首先通過化學(xué)光譜法高通量篩選了與遺傳信息載體DNA有相互作用的,具有潛在細(xì)胞毒性的化合物,并在免疫細(xì)胞RAW264.7和神經(jīng)細(xì)胞PC12體外細(xì)胞模型上,對(duì)其與細(xì)胞核DNA的相互作用和細(xì)胞毒性機(jī)理進(jìn)行了研究;第二部分,采用了計(jì)算機(jī)分子模擬方法對(duì)一系列潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行了類雌激素效應(yīng)的高通量篩選,同時(shí)在人工重組轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)中對(duì)雌

4、激素活性進(jìn)行了高通量評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。最后我們選擇具有典型雌激素效應(yīng)的手性有機(jī)氯農(nóng)藥三氯殺蟲酯,結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在兩種不同的細(xì)胞模型中對(duì)其類雌激素效應(yīng)和對(duì)生殖健康潛在影響的分子機(jī)理進(jìn)行了研究,結(jié)論如下:
　　 1.紫外光譜法結(jié)果顯示,功夫菊酯(lambda-cyhalothrin,λ-LCT)與小牛胸腺DNA(ctDNA)相互作用最為明顯。RAW264.7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:λ-LCT對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性,其細(xì)胞毒性

5、可能與λ-LCT介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DNA損傷有關(guān)。
　　 2.熒光光譜法篩選了16種農(nóng)藥對(duì)DNA-EB熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果顯示聯(lián)吡啶類除草劑敵草快(diquat,DQ)能夠誘導(dǎo)DNA-EB體系發(fā)生熒光淬滅,因此選擇DQ作為目標(biāo)化合物,對(duì)其在PC-12細(xì)胞上的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:DQ對(duì)PC-12細(xì)胞具有明顯的毒性,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,并可以導(dǎo)致細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚。我們認(rèn)為DQ與DNA通過靜電相互作用是其潛在的細(xì)胞毒性的一個(gè)可能

6、原因。
　　 3.我們通過人工重組轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)多種菊酯類農(nóng)藥的雌激素效應(yīng)的對(duì)映體選擇性進(jìn)行了高通量評(píng)價(jià),結(jié)果表明,其中三種cis-聯(lián)苯菊酯(Cis-bifenthrin,Cis-BF)、氯菊酯(Permethrin,PM)和氰戊菊酯(Fenvalerate,Fen)具有明顯的雌激素活性對(duì)映體選擇性。Cis-BF的潛在雌激素效應(yīng)能力大小順序?yàn)?1S-cis-BF＞cis-BF＞1R-cis-BF。PM和Fen的外消旋體在轉(zhuǎn)基因酵母

7、系統(tǒng)中均未表現(xiàn)出明顯的雌激素效應(yīng),但它們的兩個(gè)對(duì)映體均能誘導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)。分子對(duì)接技術(shù)為我們提供了一種有關(guān)研究手性配體與受體之間選擇性結(jié)合而引起對(duì)映體選擇的生物學(xué)差異的新方法。
　　 4.通過Molegro Virtual Docker(MVD)對(duì)接軟件篩選24種多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs),隨后運(yùn)用轉(zhuǎn)入人雌激素受體α(human Estrogen receptor alpha,hE

8、Rα)基因的工程酵母進(jìn)一步評(píng)價(jià)18種多氯聯(lián)苯的雌激素效應(yīng),其中15種均具有不同程度的雌激素效應(yīng)。分子對(duì)接初篩結(jié)果的準(zhǔn)確率達(dá)到了50％以上,這為今后采用基于分子對(duì)接的高通量篩選方法,對(duì)大規(guī)模數(shù)據(jù)庫化合物與靶標(biāo)間的相互作用進(jìn)行計(jì)算模擬奠定了基礎(chǔ),可以很大程度上實(shí)現(xiàn)快速檢測確定優(yōu)先污染物的目標(biāo);同時(shí)也將有助于今后分子間相互作用的機(jī)理研究。
　　 5.我們以三氯殺蟲酯(Acetofenate,AF)為模式化合物,對(duì)其在MCF-7和JEG