環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的擬雌激素活性與兒童性早熟發(fā)病的關(guān)系及其中藥治療干預(yù)的研究.pdf

1、目的：探討環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 ( environmental endocrinedisruptors，EED<,s>) 與兒童性早熟發(fā)病的關(guān)系，制定針對(duì)EED<,s>擬雌激素作用的中藥治療方案，并深入研究中藥治療的作用機(jī)理。以上海郊區(qū)養(yǎng)殖池塘的水生生物為代表，檢測(cè)其EED<,s>的暴露水平，作為追蹤人類機(jī)體暴露于EED<,s>的來(lái)源的一種探索。 方法： (1)采用氣相色譜及高效液相色譜法檢測(cè)了110例性早熟患兒及性別、年齡

2、匹配的100例正常兒童血清中數(shù)種有代表性的EEDs(包括：洗滌劑降解產(chǎn)物中的辛基酚(octylphenol，OP)、合成樹(shù)脂原料中的雙酚 A (bisphenolA，BPA)、塑料增塑劑中的鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate，DBP)及鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)的含量，同時(shí)測(cè)定性早熟患兒靶器官的發(fā)育指標(biāo)，包括子宮、卵巢的體積、血清雌二醇的水平。對(duì)兩組兒童血

3、清EED<,s>含量進(jìn)行分析，并進(jìn)一步將血清EED<,s>含量與靶器官的發(fā)育指標(biāo)作相關(guān)性分析，以探討EED<,s>與性早熟發(fā)病之間的關(guān)系。 (2)以三周齡的幼年雌性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取OP、BPA、DEHP為染毒物質(zhì)，均設(shè)高中低劑量，連續(xù)喂飼14天；另選低劑量的OP和BPA混合喂飼14天，均于給藥后24h處死，以子宮重量、子宮平滑肌厚度及子宮雌激素受體基因、蛋白表達(dá)水平作為觀察指標(biāo)，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以評(píng)價(jià)

4、這幾種EED<,s>的擬雌激素活性及其劑量一效應(yīng)關(guān)系，以及不同EED<,s>之間的聯(lián)合增效作用。 (3)制定針對(duì)EED<,s>擬雌激素作用的中藥治療方案，治療EED<,s>暴露水平較高的性早熟患兒，以上述生殖器官發(fā)育水平及血清雌二醇含量作為觀察指標(biāo)，驗(yàn)證該給藥方案對(duì)EED<,s>擬雌激素活性的拮抗作用。并以該中藥合劑治療EED<,s>染毒動(dòng)物，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time FQ-PCR)及免疫組織化學(xué)方法(

5、immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)生殖器官雌激素受體(estrogenreceptor，ER)、芳香化酶(aromatase，AR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulinlike growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)的基因和蛋白表達(dá)水平，采用單因素方差分析，從中藥對(duì)靶器官上雌激素受體、雌激素合成酶及生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用的角度，探討所用中藥拮抗EED<,s>擬雌激素活性的作用機(jī)制。 (4)以三周齡的幼年雌性S

6、D大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組喂飼BPA，干預(yù)組喂飼中藥合劑+BPA，于喂飼后0.5h、1h、1.5h、4h、8h、24h、48h、72h、96h的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組處死6只，測(cè)定血清BPA的含量，采用Gauss-Neuton法分析中藥干預(yù)對(duì)BPA在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)吸收、分布及消除過(guò)程的影響，從中藥對(duì)EED<,s>在機(jī)體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)的影響角度，探討其作用機(jī)制。 (5)對(duì)采集自上海十個(gè)郊縣120個(gè)養(yǎng)殖池塘的水生生物(魚(yú)、蝦、蟹)標(biāo)本，以高效

7、液相色譜法，檢測(cè)其中幾種有代表性的EED<,s>(有機(jī)氯農(nóng)藥DDT的代謝產(chǎn)物中的二氯二苯二氯乙烯(1，1-dichloro-2，2，bis(p-chlorophenyl)ethyene，p-p-DDE)、洗滌劑降解產(chǎn)物中的壬基酚(4-nonylphenol，4-NP)及塑料增塑劑中的鄰苯二甲酸乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)在其肌肉組織中的含量，以對(duì)我們?nèi)粘Ｋ鶖z食的水生生物暴露于EED<,s>的種

8、類及其嚴(yán)重程度作出較為確切的評(píng)估。 結(jié)果： (1)部分正常兒童血清中檢測(cè)到一定含量的OP、BPA、DBP及DEHP(ND～7.42μg/l，ND～6.24μg/l，ND～0.94 μ/l，ND～0.97μg/l)，性早熟患兒血清中 OP 含量(ND～4.52μg/l)、BPA含量(ND～35.18μg/l)、DBP含量(ND～15.60μg/l) 及DEHP含量(ND～17.53μg/l) 均顯著高于正常兒童 (P<0.

9、01 )，且檢測(cè)出血清中含有上述EED<,s>的性早熟患兒的百分比也顯著高于正常兒童(P<0.001)。性早熟患兒血清中OP、BPA、DBP及DEHP的含量與子宮體積均呈顯著正相關(guān)(r=0.676，0.557,0.456，0.382；P<0.05或0.01)，血清中OP、DBP及DEHP的含量與卵巢體積均呈顯著正相關(guān)(r=0.456，0.378，0.689：P<0.05或0.01)。 (2)染毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OP及BPA各劑

10、量組的子宮、子宮/體重比、平滑肌厚度均明顯增加(P<0.01)，并且具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，喂飼OP或BPA均可使染毒動(dòng)物子宮的雌激素受體的基因、蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。OP和BPA混合喂飼，不僅可使子宮增重和平滑肌增厚比單獨(dú)喂飼者更甚 (P<0.01)，而且可促使子宮的雌激素受體的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)比單獨(dú)喂飼者更顯著上調(diào)(P<0.01)。 (3)第一部分篩查出的EED<,s>暴露水平較高的性早熟患兒經(jīng)中藥治療三

11、個(gè)月后，乳腺組織顯著消退、子宮卵巢體積顯著回縮，血清E<,2>水平顯著下降(均 P<0.01)。所用中藥合劑可使OP及BPA混合喂飼的染毒動(dòng)物子宮和卵巢的雌激素受體(ER)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-Ⅰ)的基因和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，可使卵巢的芳香化酶(AR)的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。 (4)喂飼中藥合劑，可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)BPA的吸收速率常數(shù)明顯變小，BPA的血濃度達(dá)峰時(shí)間延遲，峰濃度顯著降

12、低(均P<0.05)，但兩組間BPA的表觀分布容積及消除速率常數(shù)無(wú)明顯差異。 (5)上海郊區(qū)養(yǎng)殖池塘水生生物肌肉中EED<,s>含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，若從EED<,s>污染的種類及程度來(lái)看，以p-p-DDE的污染最為廣泛，程度也較重，4-NP污染其次，DEHP的污染相對(duì)較少、程度也較輕；而從EED<,s>污染的地域來(lái)看，杭州灣地區(qū)(南匯、奉賢、金山)及近郊城市化地區(qū)(閔行、嘉定、寶山、浦東)以p-p-DDE污染范圍相對(duì)較廣，污染程

13、度也相對(duì)較重(分別為56.9％及50％的采樣點(diǎn)p-p-DDE重度污染)；內(nèi)陸水域地區(qū)(松江、青浦)及海島地區(qū)(崇明)則以4-NP污染范圍相對(duì)較廣、污染程度相對(duì)較重(分別為43.3％及38.7％的采樣點(diǎn)4-NP中～重度污染)。 結(jié)論： (1)當(dāng)前的正常兒童已有相當(dāng)一部分暴露于EEDs。 (2)性早熟患兒EEDs 的暴露程度比正常兒童嚴(yán)重得多，并與靶器官的病變程度呈統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著正相關(guān)，因此推測(cè)EEDs與性早熟的發(fā)病密切

14、相關(guān)，是其重要的致病因素之一。 (3)染毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了EED<,s>的擬雌激素活性及其量效關(guān)系，并證實(shí)不同種類的EED<,s>之間具有聯(lián)合增效作用。 (4)制定了針對(duì)EED<,s>擬雌激素作用的中藥治療方案，并通過(guò)臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該中藥治療方案能夠顯著地拮抗EED<,s>的擬雌激素活性。 (5)所用中藥能夠顯著下調(diào)靶器官雌激素受體、雌激素合成酶(芳香化酶)及胰島素樣生長(zhǎng)因子的基因、蛋白表達(dá)水平，這可能