鴨坦布蘇病毒感染細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析及DDX3X對(duì)復(fù)制的影響.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是一種近年新發(fā)的鴨感染性疾病，被感染的鴨群首先表現(xiàn)為采食量下降，接踵而至的是產(chǎn)蛋量下降，到發(fā)病第10天，產(chǎn)蛋量能降至平常產(chǎn)蛋量的10％以內(nèi)，該病死亡率在5-30％。其致病原鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬單股正鏈RNA病毒，除了能嚴(yán)重影響產(chǎn)蛋鴨、種鴨的生產(chǎn)性能外，還能感染肉鴨、鵝、雞、麻雀、野鳥、蚊子甚至小鼠等。由于其傳播速度快，傳播途徑尚不明了，感染宿主范圍廣，以及缺乏

2、足夠有效的藥物進(jìn)行及時(shí)治療，已經(jīng)嚴(yán)重危害著我國(guó)水禽業(yè)的健康發(fā)展和人類公共衛(wèi)生安全。本研究采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)首次研究分析了DTMUV感染乳倉(cāng)鼠腎(baby hamster kidney，BHK-21)細(xì)胞前后的差異表達(dá)蛋白，并且研究了DDX3X對(duì)DTMUV復(fù)制的影響。為更好地防控該病提供理論指導(dǎo)。

3、具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.DTMUV感染BHK-21細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　為了研究DTMUV感染后宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)變化的情況，本研究采用iTRAQ技術(shù)，并與高通量雙向高效液相色譜質(zhì)譜(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS)聯(lián)用對(duì)DTMUV感染BHK-21細(xì)胞后24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和

4、分析。共鑒定到192個(gè)差異表達(dá)的宿主蛋白。與對(duì)照相比，DTMUV感染后24h，有11個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)蛋白和8個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)蛋白;DTMUV感染后48h，有25個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)蛋白151個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)蛋白。對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行包括基因本體論(Gene Ontology，GO)分析，京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明細(xì)

5、胞內(nèi)的差異表達(dá)蛋白涉及多個(gè)生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能等，且隨著DTMUV的不斷復(fù)制，感染后48h的蛋白變化明顯多于感染后24h。因此選擇感染后48h的差異表達(dá)蛋白作進(jìn)一步IPA（Ingenuity Pathway Anaylsis）分析和驗(yàn)證。在所有差異表達(dá)蛋白當(dāng)中，Toll樣受體9（Toll-like receptor9，TLR9）上調(diào)倍數(shù)最大，IPA分析其屬于抗微生物感染免疫蛋白互作網(wǎng)絡(luò)里的蛋白，而同在一個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)里的RNA解旋

6、酶DDX3X(DEAD-box helicase3，X-linked)及其家族成員DDX5則下調(diào)表達(dá)。為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步通過熒光定量qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)TLR9、DDX3X和DDX5的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。說明TLR9、DDX3X和DDX5可能參與了DTMUV的復(fù)制。
　　2.DDX3X對(duì)DTMUV復(fù)制的影響
　　為研究DDX3X對(duì)DTMUV復(fù)制的影響，本研究

7、從BHK-21細(xì)胞中克隆DDX3X基因并成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒3Flag-DDX3X。通過在BHK-21細(xì)胞中過表達(dá)或干擾DDX3X后用DTMUV感染細(xì)胞并檢測(cè)病毒復(fù)制水平，結(jié)果表明過表達(dá)DDX3X能抑制病毒的增殖，而干擾DDX3X則能促進(jìn)病毒的增殖。而有報(bào)道人源DDX3X參與多種病毒的復(fù)制過程，在人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK293T）細(xì)胞內(nèi)能通過作用于TBK1調(diào)控Ⅰ干擾素通路而抑制同為黃病毒科的登草病毒

8、(Dengue virus，DENV)的復(fù)制，為了確定BHK-21細(xì)胞內(nèi)DDX3X是否也有類似作用，本研究采用聚肌胞苷酸poly(I∶C)刺激BHK-21細(xì)胞，然后用綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein，VSV-GFP）感染細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法證明了細(xì)胞內(nèi)干擾素通路的存在。并且比對(duì)了人源和倉(cāng)鼠源的DDX3X的氨基酸

9、序列，發(fā)現(xiàn)其相似度高達(dá)98.3％，接著將3Flag-DDX3X與人源TBK1基因真核表達(dá)質(zhì)粒HA-TBK1同時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，倉(cāng)鼠源DDX3X能夠與TBK1發(fā)生相互作用，進(jìn)而又通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了二者對(duì)β干擾素（Interferon-beta，IFN-β）啟動(dòng)子活性的影響。與對(duì)照或單獨(dú)轉(zhuǎn)染HA-TBK1實(shí)驗(yàn)組相比，倉(cāng)鼠源DDX3X明顯促進(jìn)了IFN-β啟動(dòng)子活性，說明倉(cāng)鼠源DDX3X能增強(qiáng)TBK1對(duì)

10、IFN-β啟動(dòng)子的誘導(dǎo)。用同樣的方法處理HEK293T細(xì)胞，并用Trizol Reagent裂解細(xì)胞收取細(xì)胞總RNA，用熒光定量qRT-PCR檢測(cè)了在HEK293T細(xì)胞中IFN-β及下游基因的mRNA變化。結(jié)果顯示,同時(shí)轉(zhuǎn)染HA-TBK1和3Flag-DDX3X明顯促進(jìn)了IFN-β及下游STAT1、OAS、Mx1、ISG15、ISG56基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步證實(shí)了倉(cāng)鼠源DDX3X能通過TBK1增強(qiáng)對(duì)IFN-β的誘導(dǎo)，與人源DDX3X