傳染性法氏囊病病毒感染細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(InfecTiO2s Bursal Disease Virus,IBDV)屬雙RNA病毒家族成員,它主要侵害雛雞體液免疫中樞器官法氏囊中的B淋巴細(xì)胞前體,導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。由于其基因組較小,編碼蛋白少,常被作為dsRNA的模式病毒進(jìn)行研究。目前,對(duì)IBDV各病毒蛋白的生物學(xué)功能已有一定的了解,但是從細(xì)胞分子水平分析病毒蛋白間的相互作用、病毒與宿主相互關(guān)系的研究相對(duì)較少,而這些對(duì)于IBDV復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)理的闡明具有

2、重要意義。本研究以IBDV感染的宿主細(xì)胞為主要研究對(duì)象,采用熒光雙標(biāo)法分析感染細(xì)胞內(nèi)各病毒蛋白的亞細(xì)胞定位關(guān)系,采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)IBDV感染細(xì)胞的蛋白代謝變化進(jìn)行了探索,并選擇重要的差異表達(dá)蛋白開展深入的功能研究。
　　 VP1是IBDV基因組B節(jié)段編碼的一種RNA依賴的RNA聚合酶,在基因組RNA的復(fù)制和病毒粒子的組裝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究采用長(zhǎng)距離RT-PCR方法擴(kuò)增了IBDV細(xì)胞適應(yīng)毒NB株基因組B節(jié)段全長(zhǎng)e

3、DNA,將其編碼框VP1基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)上,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)了分子量約為97kDa的VP1融合蛋白,該蛋白主要以包涵體形式存在,在體外容易發(fā)生降解。以鎳柱親和純化的重組VP1蛋白為免疫原,制備獲得4株抗IBDV-VP1的特異性鼠單克隆抗體和兔多抗血清,為深入開展IBDV復(fù)制機(jī)理研究提供了有用的抗體工具。以VP1的特異性抗體為工具,分析了pEGFP-VP1和pCI-neo-VP1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及IB

4、DV感染細(xì)胞中VP1的表達(dá)分布情況。轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)表達(dá)VP1及EGFP-VP1融合蛋白均以彌散狀分布于胞漿內(nèi)；IBDV感染細(xì)胞內(nèi),感染早期VP1主要以彌散狀分布于胞漿內(nèi),感染晚期VP1聚集成大小不等的顆粒狀散在分布于胞漿內(nèi)。這表明VP1是一種胞漿內(nèi)分布蛋白,彌散和顆粒狀分布的VP1發(fā)揮不同的生物學(xué)功能,其顆粒結(jié)構(gòu)與病毒復(fù)制過(guò)程有關(guān)。
　　 以VP1抗體為工具,采用熒光雙標(biāo)法分析VP1與衣殼蛋白VP2和VP3、絲氨酸蛋白酶VP4以

5、及非結(jié)構(gòu)蛋白VP5在雞胚成纖維細(xì)胞(chicken ernbryo fibroblasts,CEF)和Vero細(xì)胞兩種宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位關(guān)系。結(jié)果顯示,VP1、VP2、VP3和VP5在兩種細(xì)胞中的表達(dá)模式基本相同,而VP4在兩種細(xì)胞中有不同的表達(dá)分布特征。其中,VP2以彌散和顆粒狀分布于胞漿內(nèi),VP2顆粒比VP1大,數(shù)量比VP1少,與VP1的部分顆粒有信號(hào)重疊的現(xiàn)象,提示該區(qū)域可能是病毒組裝的場(chǎng)所。與VP1相似,VP3也在胞漿內(nèi)形成

6、顆粒狀結(jié)構(gòu),與VP1表現(xiàn)為共定位的現(xiàn)象,這與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的VP1和VP3形成穩(wěn)定復(fù)合物參與IBDV組裝過(guò)程的結(jié)論相佐證。彌散狀聚集在胞膜上的VP5與胞漿分布的VP1不存在共定位關(guān)系,表明VP5和VP1在IBDV感染過(guò)程中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。不同于VP1、VP2、VP3和VP5,VP4在感染細(xì)胞的胞漿和核內(nèi)均有分布。在不同宿主細(xì)胞核內(nèi),VP4均形成長(zhǎng)短不等的針狀結(jié)構(gòu),在胞漿內(nèi)則不同,VP4以針狀結(jié)構(gòu)交織成網(wǎng)狀分布在CEF的胞漿內(nèi),以團(tuán)塊

7、狀結(jié)構(gòu)分布于Vero細(xì)胞的胞漿核周區(qū),胞漿內(nèi)VP4信號(hào)較弱的部位則是VP1顆粒聚集的區(qū)域。
　　 進(jìn)一步采用熒光雙標(biāo)法分析VP2、VP3和VP4在IBDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1中的表達(dá)定位關(guān)系。觀察發(fā)現(xiàn),隨著病毒感染周期的不同,VP2、VP3和VP4的表達(dá)分布模式在逐漸轉(zhuǎn)變。其中,胞漿分布的VP2由彌散狀逐漸聚集為顆粒狀和針狀結(jié)構(gòu),胞漿內(nèi)的VP3也由彌散狀聚集為顆粒狀或中空的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)；胞漿和核內(nèi)分布的VP4的變化趨勢(shì)相

8、同,均呈現(xiàn)有彌散狀→點(diǎn)針狀→短針狀→長(zhǎng)針狀和顆粒狀的變化動(dòng)態(tài),其中顆粒狀結(jié)構(gòu)只出現(xiàn)在胞漿內(nèi)。從定位關(guān)系看,胞漿內(nèi)顆粒狀和針狀的VP2與VP4表現(xiàn)為共定位,提示在感染晚期VP2和VP4存在相互作用關(guān)系,這可能與VP4對(duì)pVP2的二次剪切即VP2的加工成熟過(guò)程有關(guān)；顆粒狀的VP2和VP4大多分布在中空的團(tuán)塊狀VP3中央,提示,這些顆粒狀或團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)所在的區(qū)域是病毒復(fù)制組裝的關(guān)鍵部位,病毒的復(fù)制組裝主要發(fā)生在“病毒工廠”的周圍區(qū)域,而病毒粒子

9、的加工成熟則發(fā)生在“病毒工廠”中央。VP4的核內(nèi)分布提示,VP4除了加工剪切多聚蛋白和VP2前體蛋白外,可能還與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用,在IBDV的致病中起作用。
　　 為了從細(xì)胞分子水平大規(guī)模地分析病毒與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系,本研究采用二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,以IBDV的易感細(xì)胞CEF為感染模型,分析IBDV感染CEF后12h、48h和96h三個(gè)不同時(shí)間細(xì)胞蛋白的表達(dá)變化動(dòng)態(tài)。二維凝膠的差異表達(dá)分析顯

10、示,CEF在感染IBDV后,共有102個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)了顯著的差異表達(dá),蛋白表達(dá)變化主要發(fā)生在感染后48h和96h。采用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜法對(duì)102個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果成功鑒定81個(gè)蛋白點(diǎn)(對(duì)應(yīng)51種細(xì)胞蛋白),包括13種上調(diào)蛋白和38種下調(diào)蛋白。這些差異蛋白分別代表IBDV感染誘導(dǎo)過(guò)量表達(dá)的多聚泛素、載脂蛋白A-1、27kDa熱激蛋白1、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、真核翻譯起始因子4A異構(gòu)體2(EIF4A2)、酸性核糖體

11、磷蛋白和核糖體相關(guān)蛋白,以及IBDV感染抑制表達(dá)的參與泛素介導(dǎo)的蛋白降解、糖代謝、中間絲、mRNA翻譯和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞蛋白。實(shí)時(shí)RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平上驗(yàn)證了質(zhì)譜鑒定的38個(gè)差異表達(dá)蛋白對(duì)應(yīng)基因的變化情況,確證了質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性。借助Western blot分析,應(yīng)用單克隆抗體在蛋白水平上進(jìn)一步確認(rèn)了IBDV感染細(xì)胞中Rho蛋白解離抑制因子的表達(dá)抑制和多聚泛素的誘導(dǎo)表達(dá)。以上結(jié)果表明,IBDV感染主要引起了細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)、應(yīng)激反應(yīng)、

12、泛素-蛋白酶體通路、大分子合成、細(xì)胞代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化,這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究IBDV感染的機(jī)制和致病機(jī)理提供了有用的蛋白質(zhì)相關(guān)基礎(chǔ)信息。
　　 基于IBDV感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),IBDV感染誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,為了進(jìn)一步分析IBDV感染對(duì)宿主細(xì)胞骨架的影響,以VPl抗體為工具,采用間接免疫熒光技術(shù)定位IBDV感染細(xì)胞,同時(shí)以F-actin特異性探針FITC-phalloidin標(biāo)記微絲、

13、抗β-tubulin和vimentin抗體標(biāo)記微管和中間絲,采用熒光雙標(biāo)技術(shù)分析IBDV感染細(xì)胞中微絲、微管和中間絲三種骨架的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示,三種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)在IBDV感染細(xì)胞中均發(fā)生了特征性的變化,其中,以中心體為中心呈放射狀分布的微管結(jié)構(gòu)在IBDV感染后期部分或完全被破壞,胞漿內(nèi)致密的vimentin中間絲骨架結(jié)構(gòu)在感染后也被破壞；而微絲F-actin在感染細(xì)胞中則異常聚合,表現(xiàn)為在核內(nèi)形成針狀結(jié)構(gòu),在Vero細(xì)胞胞漿內(nèi)以

14、塊狀結(jié)構(gòu)分布在胞漿核周區(qū),在CEF胞漿內(nèi)以針狀結(jié)構(gòu)交織分布。IBDV感染細(xì)胞中F-actin的表達(dá)分布變化與VP4非常相似,提示兩者可能存在相互關(guān)系,因此進(jìn)一步采用熒光雙標(biāo)技術(shù)對(duì)F-actin和VP4進(jìn)行亞細(xì)胞定位關(guān)系分析。結(jié)果顯示,在IBDV感染的不同宿主細(xì)胞(CEF、Vero細(xì)胞和法氏囊組織細(xì)胞)的胞漿核周區(qū)和胞核內(nèi)均出現(xiàn)了F-actin與VP4共定位現(xiàn)象；而在VP4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,VP4僅分布在胞漿內(nèi),且在VP4分布的區(qū)域

15、F-actin的熒光信號(hào)更強(qiáng),表現(xiàn)為部分共定位現(xiàn)象。以上結(jié)果提示,IBDV感染細(xì)胞中VP4可能與F-actin發(fā)生相互作用,核內(nèi)出現(xiàn)的針狀F-actin及針狀VP4與IBDV感染有關(guān)。為了進(jìn)一步分析IBDV感染細(xì)胞內(nèi)VP4與F-actin的相互關(guān)系,將IBDV感染細(xì)胞用用Triton X-100進(jìn)行處理,分別以VP4和β-actin單抗對(duì)Triton X-100可溶成分進(jìn)行免疫共沉淀分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在可溶上清中只含少量VP4,且與β-ac

16、tin單體沒有相互結(jié)合關(guān)系；但在TritonX-100不溶性細(xì)胞骨架成分中檢測(cè)到大量VP4,提示VP4可能與不溶性的F-actin骨架結(jié)合在一起,從而以Triton X-100不溶形式存在。為了初步探討F-actin在IBDV感染細(xì)胞中的生物學(xué)功能,用F-actin的聚合抑制藥物細(xì)胞松弛素D(cytoD)作用IBDV感染的細(xì)胞,借助TCID50測(cè)定對(duì)比藥物處理前后病毒的產(chǎn)量和細(xì)胞上清中的病毒滴度,結(jié)果顯示,中低濃度的cytoD處理顯著降