傳染性法氏囊病毒感染的生物標記與細胞SAGE文庫的鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(InfecTiO2s bursal disease virus，IBDV)屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬，分為血清I型和血清II型。血清I型對雞有致病性，血清II型對雞無致病性。IBDV基因組由雙股RNA組成：A節(jié)段和B節(jié)段，編碼5種蛋白。B節(jié)段有一個ORF，編碼RNA依賴的RNA聚合酶(VP1)。A節(jié)段有兩個ORF，大ORF編碼病毒的VP2、VP3和VP4蛋白；小ORF編碼VP5蛋白。IBDV發(fā)病機理不清是該

2、病控制的難點。為此，本研究在轉錄組和體液免疫水平上對IBDV與宿主的相互作用進行了分析。
　　 首先，在轉錄組水平上，本研究分析了IBDV感染及IBDV編碼基因轉化對宿主Vero細胞基因轉錄的影響。以實驗室已構建的5個Long-SAGE文庫：正常Vero細胞文庫、IBDV感染的Vero細胞文庫、表達A節(jié)段編碼蛋白的單克隆Vero細胞文庫、表達VP243蛋白的單克隆Vero細胞文庫、表達VP5蛋白的單克隆Vero細胞文庫為基礎，對

3、文庫中轉錄顯著變化(P<0.05)的基因進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)217個可注釋基因的轉錄發(fā)生顯著變化。對差異轉錄基因進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質代謝、能量代謝、mRNA加工和細胞骨架相關基因轉錄變化最為顯著。57個顯著變化基因的熒光定量PCR驗證結果顯示，熒光定量PCR結果與文庫數(shù)據(jù)的符合程度是60％-70％，確證了IBDV感染及IBDV編碼基因Vero細胞SAGE文庫大規(guī)模測序基因標簽數(shù)據(jù)的正確性，這為IBDV的發(fā)病機制研究提供了大量的基因生物

4、信息。
　　 以IBDV攻毒后的法氏囊組織和感染的雞胚成纖維細胞RNA為模板，以IBDV感染Vero細胞的基因轉錄變化為線索，選取IBDV感染Vero細胞Long-SAGE文庫中顯著變化的15個基因和17個促炎性因子基因，設計雞源引物，借助熒光定量PCR方法，分析了IBDV感染的法氏囊組織和雞胚成纖維細胞的轉錄本變化。在IBDV感染的雞胚成纖維細胞中，HMGN2的顯著下調，推測與病毒感染細胞的細胞凋亡相關；促炎性因子表達普遍上調

5、，其中β干擾素(IFN-β)轉錄本上調500倍以上，其他促炎性因子如IFN-G、BAFF、IL-6、IL-1B、IL.8和iNOS也上調20倍以上。在感染IBDV的法氏囊組織中，氯離子通道蛋白4(CLIC4)顯著表達上調，推測與病毒的破膜釋放相關；促炎性因子IL-6的轉錄上調1746倍。表達上調20倍以上的基因還有TNFSF8、IFN-B、IFN-G、TNFRSFlA、IL-8和iNOS。這些數(shù)據(jù)說明，IBDV感染導致不同類型宿主細胞基

6、因變化的種類具有一致性，但變化的趨勢具有不完全一致性，充分顯示了不同類型細胞的易感差異性。
　　 在IBDV感染的法氏囊組織中，我們發(fā)現(xiàn)Cofilin基因轉錄顯著上調，為分析Cofilin基因表達與IBDV感染之間的關系，本試驗利用抗Cofilin蛋白抗體對IBDV感染的雞胚成纖維細胞和法氏囊組織進行分析，結果發(fā)現(xiàn)IBDV感染能夠激活Cofilin基因的表達。
　　 基于IBDV感染宿主細胞的轉錄本信息，為了了解宿主對I

7、BDV非結構蛋白VP4的信號反饋，以重組表達的VP4、VP3蛋白為抗原，制備了抗VP4、VP3單克隆抗體和多克隆抗體，建立了VP4抗體檢測ELISA。分析了IBDV強毒株(NB株，BC6/85株)、中等偏強毒力株（MB43株）、中等毒力株（B87株）、低毒力毒株(NB弱毒株)感染21日齡SPF Leghorn雞的VP4蛋白的體液免疫應答，ELISA抗體監(jiān)測結果顯示：IBDV強毒感染雞VP4抗體于感染后23天陽轉，40天陽性率達70％以上

8、，VP3抗體于感染后20天陽轉，23天陽性率達到100％; IBDV弱毒疫苗一次免疫雞難以檢出VP4抗體，VP3抗體于20天陽轉，23天陽性率達到88.9％。中等毒力IBDV感染后，VP4抗體陽性率為10％到40％，中等偏強毒力IBDV感染后VP4抗體陽性率為30％到60％。以IBDV VP3、VP4基因Vero細胞表達蛋白的IFA檢測出現(xiàn)了類似的結果。對感染后血清VP4抗體效價測定發(fā)現(xiàn)，強毒感染血清VP4抗體效價與中等偏強毒力、中等毒