傳染性法氏囊病毒感染的生物標(biāo)記與細(xì)胞SAGE文庫(kù)的鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(InfecTiO2s bursal disease virus，IBDV)屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬，分為血清I型和血清II型。血清I型對(duì)雞有致病性，血清II型對(duì)雞無(wú)致病性。IBDV基因組由雙股RNA組成：A節(jié)段和B節(jié)段，編碼5種蛋白。B節(jié)段有一個(gè)ORF，編碼RNA依賴的RNA聚合酶(VP1)。A節(jié)段有兩個(gè)ORF，大ORF編碼病毒的VP2、VP3和VP4蛋白；小ORF編碼VP5蛋白。IBDV發(fā)病機(jī)理不清是該

2、病控制的難點(diǎn)。為此，本研究在轉(zhuǎn)錄組和體液免疫水平上對(duì)IBDV與宿主的相互作用進(jìn)行了分析。
　　 首先，在轉(zhuǎn)錄組水平上，本研究分析了IBDV感染及IBDV編碼基因轉(zhuǎn)化對(duì)宿主Vero細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的影響。以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的5個(gè)Long-SAGE文庫(kù)：正常Vero細(xì)胞文庫(kù)、IBDV感染的Vero細(xì)胞文庫(kù)、表達(dá)A節(jié)段編碼蛋白的單克隆Vero細(xì)胞文庫(kù)、表達(dá)VP243蛋白的單克隆Vero細(xì)胞文庫(kù)、表達(dá)VP5蛋白的單克隆Vero細(xì)胞文庫(kù)為基礎(chǔ)，對(duì)

3、文庫(kù)中轉(zhuǎn)錄顯著變化(P<0.05)的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)217個(gè)可注釋基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生顯著變化。對(duì)差異轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)代謝、能量代謝、mRNA加工和細(xì)胞骨架相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄變化最為顯著。57個(gè)顯著變化基因的熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，熒光定量PCR結(jié)果與文庫(kù)數(shù)據(jù)的符合程度是60％-70％，確證了IBDV感染及IBDV編碼基因Vero細(xì)胞SAGE文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序基因標(biāo)簽數(shù)據(jù)的正確性，這為IBDV的發(fā)病機(jī)制研究提供了大量的基因生物

4、信息。
　　 以IBDV攻毒后的法氏囊組織和感染的雞胚成纖維細(xì)胞RNA為模板，以IBDV感染Vero細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄變化為線索，選取IBDV感染Vero細(xì)胞Long-SAGE文庫(kù)中顯著變化的15個(gè)基因和17個(gè)促炎性因子基因，設(shè)計(jì)雞源引物，借助熒光定量PCR方法，分析了IBDV感染的法氏囊組織和雞胚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本變化。在IBDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞中，HMGN2的顯著下調(diào)，推測(cè)與病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡相關(guān)；促炎性因子表達(dá)普遍上調(diào)

5、，其中β干擾素(IFN-β)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)500倍以上，其他促炎性因子如IFN-G、BAFF、IL-6、IL-1B、IL.8和iNOS也上調(diào)20倍以上。在感染IBDV的法氏囊組織中，氯離子通道蛋白4(CLIC4)顯著表達(dá)上調(diào)，推測(cè)與病毒的破膜釋放相關(guān)；促炎性因子IL-6的轉(zhuǎn)錄上調(diào)1746倍。表達(dá)上調(diào)20倍以上的基因還有TNFSF8、IFN-B、IFN-G、TNFRSFlA、IL-8和iNOS。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，IBDV感染導(dǎo)致不同類型宿主細(xì)胞基

6、因變化的種類具有一致性，但變化的趨勢(shì)具有不完全一致性，充分顯示了不同類型細(xì)胞的易感差異性。
　　 在IBDV感染的法氏囊組織中，我們發(fā)現(xiàn)Cofilin基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，為分析Cofilin基因表達(dá)與IBDV感染之間的關(guān)系，本試驗(yàn)利用抗Cofilin蛋白抗體對(duì)IBDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞和法氏囊組織進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBDV感染能夠激活Cofilin基因的表達(dá)。
　　 基于IBDV感染宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本信息，為了了解宿主對(duì)I

7、BDV非結(jié)構(gòu)蛋白VP4的信號(hào)反饋，以重組表達(dá)的VP4、VP3蛋白為抗原，制備了抗VP4、VP3單克隆抗體和多克隆抗體，建立了VP4抗體檢測(cè)ELISA。分析了IBDV強(qiáng)毒株(NB株，BC6/85株)、中等偏強(qiáng)毒力株（MB43株）、中等毒力株（B87株）、低毒力毒株(NB弱毒株)感染21日齡SPF Leghorn雞的VP4蛋白的體液免疫應(yīng)答，ELISA抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：IBDV強(qiáng)毒感染雞VP4抗體于感染后23天陽(yáng)轉(zhuǎn)，40天陽(yáng)性率達(dá)70％以上

8、，VP3抗體于感染后20天陽(yáng)轉(zhuǎn)，23天陽(yáng)性率達(dá)到100％; IBDV弱毒疫苗一次免疫雞難以檢出VP4抗體，VP3抗體于20天陽(yáng)轉(zhuǎn)，23天陽(yáng)性率達(dá)到88.9％。中等毒力IBDV感染后，VP4抗體陽(yáng)性率為10％到40％，中等偏強(qiáng)毒力IBDV感染后VP4抗體陽(yáng)性率為30％到60％。以IBDV VP3、VP4基因Vero細(xì)胞表達(dá)蛋白的IFA檢測(cè)出現(xiàn)了類似的結(jié)果。對(duì)感染后血清VP4抗體效價(jià)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒感染血清VP4抗體效價(jià)與中等偏強(qiáng)毒力、中等毒