傳染性法氏囊病毒粒子感染及其A節(jié)段編碼基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本初步分析.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)侵染雞法氏囊組織的B淋巴母細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。為了探索IBDV感染及其編碼基因轉(zhuǎn)化對(duì)宿主細(xì)胞代謝的影響，本論文以Vero細(xì)胞為模型，利用LongSAGE技術(shù)(Long serial analysis of gene expression，LongSAGE)，對(duì)IBDV感染、A節(jié)段、VP2/4/3、VP5基因轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)差

2、異分析，從不同角度挖掘病毒感染過(guò)程中，細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，尋找病毒感染與細(xì)胞抗病毒過(guò)程中重要的基因及其相關(guān)通路。 (一)傳染性法氏囊病病毒A節(jié)段eDNA克隆 以傳染性法氏囊病病毒NB株(弱毒株)基因組dsRNA為模板，采用LA-PCR一步法擴(kuò)增并克隆了IBDV基因組A節(jié)段全長(zhǎng)cDNA。序列測(cè)定結(jié)果表明，IBDV基因組A節(jié)段全長(zhǎng)共3,259個(gè)核苷酸，包括5’、3’-端的非編碼區(qū)(NCR)和兩個(gè)部分重疊的開(kāi)放閱讀框(

3、ORF1和ORF2)，與GenBank中IBDV其他毒株同源性為81.8-99.9％，與JDl、Cu-1、P2、CEF94等毒株的關(guān)系最近，而與歐洲、香港、日本的超強(qiáng)毒株和美國(guó)的變異株相對(duì)較遠(yuǎn)。其中ORF1編碼1012個(gè)氨基酸的多聚蛋白(VP2/4/3)與JD1同源性高達(dá)99.5％，VP2片段與JD1、CEF94和D78同源性為99.8％，VP3片段與JD1同源性99.2％，VP4片段與JD1同源性100％，VP5片段與JD1、HZ2、

4、P2、CEF94、CT、Cu-1和D78同源性99.3％。 (二)表達(dá)IBDV編碼基因的Vero克隆化細(xì)胞系構(gòu)建 將IBDV A節(jié)段、VP2/4/3、VP5、VP2、VP3等基因片段分別克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-C2和pCI-neo，構(gòu)建了pEGFP-VP5、pEGFP-pVP2系列、pCI-neo-A、pCI-neo-VP2/4/3、pCI-neo-VP5、 pCI-neo-VP3、pCI-neo-pVP2系列等2

5、1種真核表達(dá)質(zhì)粒，在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，利用熒光顯微鏡進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，結(jié)果顯示：pEGFP-VP5轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后4-5h，能在細(xì)胞膜周圍觀察到與EGFP融合表達(dá)的VP5蛋白；pEGFP-pVP2系列蛋白在轉(zhuǎn)染后9-12h開(kāi)始出現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用非融合表達(dá)的pCI-neo重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，在G418抗性篩選下，進(jìn)行表達(dá)IBDV A、VP2/4/3、VP5、VP2、v

6、P3細(xì)胞的克隆，通過(guò)PCR/Southern blot、RT-PCR/Northern blot、IFA/IPMA等鑒定，獲得了以下克隆化細(xì)胞系：獲得了2株A節(jié)段可穩(wěn)定表達(dá)其編碼蛋白VP2、VP4、VP3和VP5蛋白的克隆化細(xì)胞系；獲得了3株能穩(wěn)定表達(dá)VP2、VP4、VP3的含VP2/4/3基因克隆化Vero細(xì)胞；獲得了7株能穩(wěn)定表達(dá)IBDV VP5蛋白的克隆化細(xì)胞：獲得了17株能持續(xù)性表達(dá)不同VP2截短蛋白的克隆化細(xì)胞系；獲得了3株穩(wěn)

7、定表達(dá)VP3蛋白的克隆化細(xì)胞系。 (三)LongSAGE文庫(kù)構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用LongSAGE技術(shù)，分別從IBDV感染的Vero細(xì)胞、Vero-A+9C4細(xì)胞、Vero-VP2/4/3+4G8細(xì)胞、Vero-VP5+2F11細(xì)胞及正常Vero細(xì)胞中抽提mRNA，建立了5個(gè)LongSAGE文庫(kù)。驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率與轉(zhuǎn)化子大小后，各文庫(kù)隨機(jī)選取2000個(gè)插入片段大于500bp的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測(cè)序分析。共獲得代表24475(占總

8、標(biāo)簽數(shù)的25.44％)種不同轉(zhuǎn)錄本的96213個(gè)隨機(jī)標(biāo)簽，3124種轉(zhuǎn)錄本能與在人類染色體上找到相應(yīng)位置(定位率為12.76％)。其中，從IBDV感染的Vero細(xì)胞庫(kù)中獲得代表9187種不同轉(zhuǎn)錄本的22193個(gè)標(biāo)簽；從正常Vero細(xì)胞庫(kù)中獲得代表8369種不同轉(zhuǎn)錄本的17663個(gè)標(biāo)簽；從Vero-VP5細(xì)胞庫(kù)中獲得代表7130種不同轉(zhuǎn)錄本的14221個(gè)標(biāo)簽；從Vero-A細(xì)胞庫(kù)中獲得代表10160種不同轉(zhuǎn)錄本的22968個(gè)標(biāo)簽；從Ver

9、o-VP2/4/3細(xì)胞庫(kù)中獲得代表8840種不同轉(zhuǎn)錄本的19168個(gè)標(biāo)簽。 庫(kù)間轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異分析顯示：與正常的細(xì)胞相比較(P<0.05)，IBDV感染的細(xì)胞出現(xiàn)37種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)、84種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)，Vero-A細(xì)胞出現(xiàn)40種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)、104種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)，Vero-VP2/4/3細(xì)胞出現(xiàn)43種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)、74種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)，Vero-VP5細(xì)胞出現(xiàn)36種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)、18種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)。與IBDV感染細(xì)

10、胞相比(P<0.05)，Vero-A細(xì)胞(335種轉(zhuǎn)錄本)、Vero-VP2/4/3細(xì)胞(334種轉(zhuǎn)錄本)、Vero-VP5細(xì)胞(91種轉(zhuǎn)錄本)出現(xiàn)顯著水平的表達(dá)差異。與Vero-A細(xì)胞相比較，Vero-VP2/4/3細(xì)胞(49種轉(zhuǎn)錄本)、Vero-VP5細(xì)胞(113種轉(zhuǎn)錄本)出現(xiàn)表達(dá)水平的顯著差異。與Vero-VP2/4/3細(xì)胞相比較，Vero-VP5細(xì)胞(104種轉(zhuǎn)錄本)均出現(xiàn)表達(dá)水平的顯著差異。染色體定位結(jié)果顯示：在23條人類染色