牛分枝桿菌感染THP--1細胞蛋白質(zhì)組學分析及PMN在宿主應答其感染過程中的功能探索.pdf

1、結核病(tuberculosis，TB)主要是經(jīng)呼吸道吸入結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）和牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的氣溶膠而引起的人畜共患傳染病。M.bovis能夠感染包括人和牛在內(nèi)的多個宿主，并且能在牛和人之間廣泛傳播，從而嚴重危害著食品安全和公共衛(wèi)生健康。全球大約三分之一的人感染了M.tb并長期處于潛伏性感染狀態(tài)(Latent TB in

2、fection，LTBI)。然而LTBI患者缺乏典型的結核病臨床病理特征，大約有5％～10％的LTBI患者中會發(fā)展成活動性結核病，一旦感染了人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）后LTBI患者結核病的發(fā)病率將提高21～34倍。目前，唯獨被批準用于預防結核病的疫苗為卡介苗(Bacille Calmette-Gue'rin，BCG)，其是人工體外培養(yǎng)M.bovis連續(xù)傳代所得的減毒活疫苗。但卡介

3、苗對成人肺結核患者免疫保護力約為60％，并且在免疫缺陷的接種人群中容易發(fā)展為散播性卡介苗(Disseminated BCG)。骨髓源細胞表達的觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)，通過調(diào)控Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)誘導的信號而調(diào)節(jié)先天免疫反應，并因此在微調(diào)炎癥反應過程中發(fā)揮著關鍵作用。TREM1在傳染性急性炎癥疾病中具有診斷

4、前景，包括結核胸膜肺炎;并且在非傳染性炎癥疾病及癌癥中有治療前景，例如動脈粥樣硬化。目前，全球結核病面臨的挑戰(zhàn)包括:對M.bovis感染人致病的傳播機制缺乏認識，BCG對肺結核患者保護力低下的機制仍然并不清楚，而且對潛伏性結核患者缺乏有效診斷方法和治療手段。
　　因此本課題通過同位素標記相對與絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術分析了兩

5、種強毒性分枝桿菌復合體（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）菌株，包括M.tb-H37Rv和M.bovis，以及疫苗菌株BCG感染的人巨噬細胞（Human monocytes，THP-1）的差異蛋白質(zhì)組。探討了強毒株M.bovis感染人細胞過程中，潛在的免疫應答和傳播機制。并以減毒疫苗株BCG感染小鼠，解析宿主的免疫應答過程和宿主細胞殺傷BCG的機制。接著以TREM1基因缺失小鼠作為動物模型，

6、探討TREM1介導的BCG感染宿主后差異應答反應。進一步揭示了，BCG誘導宿主的免疫應答及肺外結核病發(fā)展的分子機制。并且利用溫敏性噬菌體轉染的方法，高效而快速的獲取phoP、Rv1759c和LprG等相關基因的缺失株。在獲取結核分枝桿菌基因缺失菌株的基礎上，探索相關基因與細胞及小鼠互作過程中的差異反應。通過病原菌基因改造、免疫調(diào)節(jié)和藥物調(diào)控三方面并從病原與宿主互作的過程開展研究，為結核病的防治提供新思路。主要研究內(nèi)容如下:
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7、.強弱毒株感染人巨噬細胞差異蛋白組學分析
　　成功獲得MTBC強弱毒株感染THP-1細胞的差異蛋白表達譜，特別是牛源強毒株M.bovis誘導人巨噬細胞蛋白質(zhì)改變。共同鑒定了2032個蛋白質(zhì)，其中61個具有顯著性差異。利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)進一步分析發(fā)現(xiàn)，強毒株誘導的差異蛋白最顯著的是吞噬體成熟通路和TNF信號通路，所涉及差異蛋白包括IFIT1、IFIT3、CCL20和ICAM1。61個差

8、異蛋白中31個參與囊泡運輸，由強毒株誘導的五個共同的差異蛋白包括NCF1和ICAM1，彼此相互作用且涉及免疫相關的信號通路，如白細胞跨內(nèi)皮細胞遷移通路。BCG與H37Rv誘導THP-1不同的吞噬體成熟通路。不同毒力的分枝桿菌菌株感染巨噬細胞后，都能誘導大量差異顯著的炎性細胞因子上調(diào)表達，但M.bovis誘導細胞IL-4表達水平顯著性下調(diào)。溶酶體適配器蛋白LAMTOR2可能是牛分枝桿菌胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)臐撛诎袠?。揭示由M.bovis感染獨特地

9、誘導的MTHFD2，VPS26A和TBC1D9B蛋白，為結核病由牛到人的宿主傳播靶點和新的生物診斷標識物。
　　2.PMN在宿主應答B(yǎng)CG感染過程中的功能探索
　　C57BL/6小鼠經(jīng)呼吸道滴鼻方式感染BCG后，經(jīng)流式細胞分析發(fā)現(xiàn)宿主通過中性粒細胞(Neutrophils，PMN)殺傷BCG，并且發(fā)現(xiàn)組織臟器存在不同程度的病理損傷。隨著感染時間的推移，小鼠肺部的BCG逐漸被清除，在感染28天肺部檢測不到BCG。經(jīng)不同的感染途

10、徑，TREM1-/-小鼠所產(chǎn)生的病理損傷程度不相同，宿主免疫應答過程也存在差別。經(jīng)呼吸道滴鼻方式感染BCG相比于尾靜脈注射感染方式，TREM1-/-小鼠能產(chǎn)生更嚴重水平的肺部損傷和體重下降，并且伴隨著肺臟、脾臟質(zhì)量增加，及在感染7天肺組織能夠分離出BCG。不同的感染途徑，免疫組化分析TREM1-/-小鼠脾臟和肺臟組織均能產(chǎn)生高水平的PMN，但是對病原菌在肺部的殺傷能力不同。經(jīng)尾靜脈注射BCG感染后50天，施用免疫抑制劑地塞米松藥物處理2

11、周，TREM1-/-小鼠存活時間延長。通過尾靜脈注射人源強毒株H37Rv后，TREM1-/-小鼠能夠產(chǎn)生差異顯著的IL-1β與IL-12。綜上說明，宿主通過PMN能夠有效的殺傷BCG，但是缺乏TREM1后肺部殺傷能力減弱。TREM1與PMN可能是結核分枝桿菌感染過程中，銜接宿主天然免疫與適應性免疫應答的紐帶。而TREM1抑制劑與地塞米松可能為未來臨床肺外結核病患者治療提供新的思路。
　　3.H37RvΔphoPΔRv1759cΔL

12、prG基因缺失菌株的構建
　　利用噬菌體轉染通過同源重組，成功構建了H37RvΔphoPΔRv1759cΔLprG及M.bovisΔphoPΔLprG缺失菌株。通過菌落形態(tài)試驗肉眼觀察，H37RvΔphoP與H37RvΔphoPΔRv175cΔLprG的嵴狀蜿蜒程度與親本菌株相比減弱，特別是H37RvΔphoP。接著進行了細胞與小鼠感染，H37RvΔphoPΔRv175cΔLprG缺失對菌株入侵巨噬細胞的能力顯著性降低，且能誘導細