結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞鈣通道的表達(dá)及維拉帕米對(duì)其免疫功能的影響.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染性疾病，在本世紀(jì)仍然是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。從使用抗結(jié)核藥治療開始，就出現(xiàn)了有關(guān)結(jié)核耐藥的報(bào)道，但是并沒有引起人們足夠的重視。近年來，由于耐多藥結(jié)核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)導(dǎo)致的死亡率不斷上升，研制有效的抗結(jié)核藥物已迫在眉睫。
　　維拉帕米(Verapamil，VP)是一種苯烷胺類鈣通道阻滯劑，是

2、L-型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC)的特異性阻滯劑，與LTCC的α1亞基受體結(jié)合，降低鈣通道的開放率。在臨床上，它主要用于心血管系統(tǒng)疾病的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)維拉帕米在肺結(jié)核的聯(lián)合化療中顯示出潛在的治療價(jià)值，它能增強(qiáng)化療的效果，縮短療程，并降低耐藥率，也有充分的研究數(shù)據(jù)表明LTCC是一個(gè)極具前景的抗結(jié)核藥治療靶點(diǎn)，已成為一個(gè)新藥研究方向。
　　本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse tra

3、nscription-Polymerasechain reaction，RT-PCR)半定量技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染情況下，巨噬細(xì)胞(Macrophage，MΦ)鈣通道表達(dá)變化的規(guī)律，并研究維拉帕米對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。了解M.tb感染的巨噬細(xì)胞在不同濃度的維拉帕米作用下，促炎基因表達(dá)和炎性相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況。
　　一、結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞鈣通

4、道的表達(dá)
　　將56只小鼠隨機(jī)分為七組，每組8只，用M.tb強(qiáng)毒株H37Rv、弱毒株H37Ra、卡介苗(Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin,BCG)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）分別感染小鼠24小時(shí)后，腹腔灌洗收獲巨噬細(xì)胞，用RT-PCR半定量技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞LTCC mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示M.tb感染后巨噬細(xì)胞LTCC在基因水

5、平表達(dá)增加，與正常對(duì)照組和S.aureus感染組相比差異顯著(P＜0.05)，金黃色葡萄球菌感染的巨噬細(xì)胞LTCC在基因水平表達(dá)與正常對(duì)照組相比無顯著變化(P＞0.05)。
　　二、維拉帕米對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響
　　將60只小鼠隨機(jī)分為兩組，一組為正常對(duì)照組，另一組為M.tbH37Rv感染組，飼養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行腹腔灌洗收獲巨噬細(xì)胞，將收獲的正常組和感染組巨噬細(xì)胞均隨機(jī)分為9組，分別加入濃度為0μg/ml、1μg/ml、5

6、μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml的維拉帕米，培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取RNA，應(yīng)用RT-PCR半定量技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-12和核因子-κB(nuclearfactor-kappa B，NF-κB)的mRNA表達(dá)水平。收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液，通過ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-12(p40)、腫瘤壞死因子（tumor n

7、ecrosis factor，TNF-α）、IL-1β和細(xì)胞裂解液中NF-κBp65(pS536)、NF-κ Bp65(Total)含量。結(jié)果顯示:與無維拉帕米作用的正常組比較，感染組巨噬細(xì)胞IL-12和NF-κBmRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12(p40)的含量和巨噬細(xì)胞裂解液中NF-κBp65(pS536)、NF-κBp65(Total)的含量也顯著增高(P＜0.05);當(dāng)加入的維拉帕米在一定濃度

8、范圍內(nèi)，感染組巨噬細(xì)胞IL-12和NF-κB mRNA的表達(dá)、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12(p40)的含量和巨噬細(xì)胞裂解液中NF-κBp65(pS536)、NF-κBp65(Total)的含量是增加的，當(dāng)維拉帕米濃度≥50μg/ml時(shí)，這些基因的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌與無維拉帕米作用的正常組相比，無顯著差異(P＞0.05)。與無維拉帕米作用的正常組相比，感染組分泌的IL-1β和TNF-α水平都顯著增高(P＜0.01)。感染組分泌的IL-1

9、β和TNF-α隨著維拉帕米濃度的增加呈劑量依賴性遞減。當(dāng)維拉帕米的濃度≥25μg/ml時(shí)，感染組IL-1β和TNF-α與無維拉帕米作用的正常組相比，無明顯差異(P＞0.05)。維拉帕米對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌影響較少。上述結(jié)果表明，在M.tb感染情況下，巨噬細(xì)胞的LTCC表達(dá)增加，IL-12和NF-κB無論在基因水平還是在細(xì)胞水平表達(dá)都顯著增加，IL-1β和TNF-α的分泌也顯著增多。一定濃度范圍內(nèi)的鈣通道阻滯劑維拉帕米作用于巨噬細(xì)胞，