SUMO-1修飾ataxin-3及其在SCA3-MJD發(fā)病機制中的作用.pdf

1、polyQ疾病是一類常見的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳變性性疾病，其發(fā)生主要是由疾病基因編碼區(qū)CAG三核苷酸重復(fù)擴展突變導(dǎo)致相應(yīng)基因所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生polyQ擴展突變所致。截至目前，已發(fā)現(xiàn)的polyQ疾病至少有九種，分別是SCA1、2、3、6、7、17型、HD、DRPLA以及SBMA。polyQ疾病的主要病理學(xué)標(biāo)志是病變受累神經(jīng)元內(nèi)形成核內(nèi)或胞漿包涵體，在polyQ疾病的細(xì)胞模型中則表現(xiàn)為核內(nèi)或胞漿蛋白聚合體的形成。polyQ疾病的發(fā)病機制目前并未完

2、全闡明，但polyQ擴展突變導(dǎo)致polyQ蛋白獲得細(xì)胞毒性是其致病的關(guān)鍵這點已取得大家的共識：突變的polyQ蛋白單體或由其所形成的蛋白聚合體可能通過損害泛素-蛋白酶體通路、抑制轉(zhuǎn)錄、激活caspase以及產(chǎn)生線粒體毒性等機制而致病。SUMO-1是一種與泛素同源的小分子修飾蛋白，但與泛素修飾底物蛋白主要導(dǎo)致底物蛋白被蛋白酶體降解不同的是：底物蛋白蘇素化(sumoylation)主要與底物蛋白的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、底物蛋白生理功能的

3、調(diào)節(jié)等密切相關(guān)，已有研究表明SUMO-1修飾某些擴展突變的polyQ蛋白可使其細(xì)胞毒性增加。ataxin-3是SCA3/MJD致病基因MJD1編碼的polyQ蛋白，與其它多數(shù)polyQ蛋白一樣，ataxin-3的正常生理功能以及其polyQ擴展突變后如何致病目前并不完全清楚，關(guān)于ataxin-3與SUMO-1的關(guān)系目前也沒有研究報道。我們在前期研究中通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)在酵母中證明SUMO-1是ataxin-3的互作蛋白，進一步在哺

4、乳動物細(xì)胞中明確SUMO-1是否修飾ataxin-3以及這種修飾可能具有的病理生理學(xué)意義無疑將有助于闡明ataxin-3的正常生理功能以及SCA3/MJD乃至其它polyQ疾病的發(fā)病機制。 在本實驗中，我們首先成功構(gòu)建了SUMO-1、野生型以及polyQ擴展突變型ataxin-3的真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1/Hygro(-)-SUMO-1、pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD20Q、pCDNA3.1-Myc-His

5、(-)B-MJD68Q。三個質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞后，相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達均通過Western印跡和免疫熒光得以驗證：轉(zhuǎn)染了pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD20Q和pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的細(xì)胞分別成功地表達了分子量約為50kD和60kD的ataxin-3-20Q-c-Myc和ataxin-3-68Q-c-Myc；ataxin-3-20Q-c-Myc均勻分布于胞漿和胞核，ata

6、xin-3-68Q-c-Myc雖在多數(shù)細(xì)胞也均勻分布于胞漿和胞核，但在部分細(xì)胞的核內(nèi)可形成蛋白聚合體；轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pCDNA3.1/Hygro(-)-SUMO-1的細(xì)胞表達的SUMO-1主要有17kD的游離形式和90kD的結(jié)合形式兩種存在形式，而內(nèi)源性SUMO-1絕大多數(shù)以90kD的結(jié)合形式存在，內(nèi)源性和外源性的SUMO-1均主要以斑點狀形式分布于核內(nèi)。 轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD20Q和pCDNA3.1

7、-Myc-His(-)B-MJD68Q的細(xì)胞中用c-Myc抗體除檢測到50kD和60kD的ataxin-3-c-Myc蛋白主帶外，另外還檢測到兩條弱的比ataxin-3-c-Myc蛋白主帶分子量高的蛋白質(zhì)條帶，其中一條比ataxin-3-c-Myc蛋白主帶分子量高了約17kD，恰好與SUMO-1修飾底物蛋白所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表觀分子量變化一致，高度提示ataxin-3可能被SUMO-1修飾。生物信息學(xué)分析也顯示ataxin-3的氨基酸序列中

8、存在一個高度可能的蘇素化位點。進一步我們綜合利用免疫熒光和免疫共沉淀實驗證實了ataxin-3的確是SUMO-1的底物蛋白之一：免疫熒光結(jié)果顯示：polyQ擴展突變型ataxin-3所形成的核內(nèi)蛋白聚合體以及野生型ataxin-3均與SUMO-1在細(xì)胞核內(nèi)形成的斑點狀分布重疊；在單轉(zhuǎn)ataxin-3表達載體和共轉(zhuǎn)ataxin-3與SUMO-1表達載體的兩組細(xì)胞，其全細(xì)胞裂解液用c-Myc抗體免疫沉淀后用SUMO-1抗體免疫印跡或者用SU

9、MO-1抗體免疫沉淀后用c-Myc抗體免疫印跡均可檢測到一條比ataxin-3主帶分子量高17kD的蛋白條帶-即蘇素化的ataxin-3。突變ataxin-3在全身各組織廣泛表達但SCA3/MJD卻只選擇性累及神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)元所處的特定的細(xì)胞周期-靜止期可能與神經(jīng)元對突變ataxin-3的細(xì)胞毒性特別敏感有關(guān)，對體外培養(yǎng)細(xì)胞采取血清饑餓處理使其同步在G0/G1期可能能更客觀地模擬SCA3/MJD的發(fā)病過程。鑒于此，在研究ataxin-3

10、蘇素化的病理生理學(xué)意義時，我們對細(xì)胞分別采取正常血清培養(yǎng)和血清饑餓兩種處理。對SUMO-1則采取過表達以及利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)其表達兩種處理方式。轉(zhuǎn)染了ataxin-3表達質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)上述各相應(yīng)處理后，在激光共聚焦顯微鏡下計數(shù)有核內(nèi)蛋白聚合體形成的細(xì)胞數(shù)并運用MTT法檢測細(xì)胞活性。結(jié)果：單轉(zhuǎn)pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的細(xì)胞，血清饑餓處理組與正常血清培養(yǎng)組比較，有核內(nèi)蛋白聚合體形成的細(xì)胞數(shù)增加而細(xì)胞活性下降，

11、組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與單轉(zhuǎn)pCDNA3.1-Myc-His(-)B-MJD68Q的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)SUMO-1表達載體可使有核內(nèi)蛋白聚合體形成的細(xì)胞數(shù)目增多而細(xì)胞活性下降，共轉(zhuǎn)SUMO-1的RNA干擾載體可使有核內(nèi)蛋白聚合體形成的細(xì)胞數(shù)目減少而細(xì)胞活性上升。但是，這種由SUMO-1的表達差異所帶來的有核內(nèi)蛋白聚合體形成的細(xì)胞數(shù)目以及細(xì)胞活性的改變，只有在血清饑餓處理組才有統(tǒng)計學(xué)意義，在正常血清培養(yǎng)組并無統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明蘇素化后突