bFGF通過磷酸化α-catenin調(diào)控成纖維細(xì)胞遷移機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　皮膚創(chuàng)傷愈合是皮膚損傷恢復(fù)中的關(guān)鍵過程，快速的細(xì)胞遷移能使受傷的皮膚更快更好的愈合。bFGF能高效的促進(jìn)細(xì)胞遷移，但其具體的作用機(jī)制尤其是激活相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)調(diào)控細(xì)胞遷移的機(jī)制尚不清楚。本研究的目的是找出 bFGF在調(diào)控成纖維細(xì)胞遷移中激活相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)并進(jìn)一步探索其具體的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　我們采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）鑒定出在bFGF處理后，有顯著性差異的磷酸化多

2、肽，并采用Western blot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。之后采用Western blot、免疫沉淀和細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn)檢測受 bFGF調(diào)控的磷酸化蛋白α-catenin具體作用機(jī)制及其在促成纖維細(xì)胞遷移中所起的作用。運(yùn)用小干擾RNA實(shí)驗(yàn)抑制內(nèi)源性的α-catenin后，再通過CCK-8、細(xì)胞遷移劃痕、3D細(xì)胞侵襲以及核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)研究在α-catenin干擾后，具體存在的分子作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　在此項(xiàng)研究中，我們先用100

3、 ng/mL bFGF處理和未處理人的真皮成纖維細(xì)胞消化分離得到磷酸化多肽，再應(yīng)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法比較兩者的差異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF處理組能明顯上調(diào)包括α-catenin Ser641在內(nèi)等9種磷酸化多肽、同時下調(diào)5種磷酸化多肽的表達(dá)。另外還發(fā)現(xiàn)LiCl（GSK3β（Ser9）抑制劑）和Bay（p-IκBα抑制劑）都能提高α-catenin Ser641的磷酸化及α-catenin總蛋白的表達(dá)水平。此外，α-catenin Ser64

4、1磷酸化水平調(diào)控不受ERK1/2的影響。bFGF和蛋白酶體抑制劑MG132能同時提高磷酸化α-catenin和總α-catenin的表達(dá)，然而CK2的抑制劑TBB作用則起到相反的抑制效果。這些結(jié)果提示α-catenin Ser641發(fā)生磷酸化后通過抑制α-catenin泛素化降解使α-catenin積累，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了這一結(jié)論。我們還證實(shí)CK2的抑制劑TBB作用能明顯抑制成纖維細(xì)胞的遷移。在干擾內(nèi)源性α-catenin的表達(dá)后，