姜黃素激活自噬減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的研究.pdf

1、背景：姜黃素是傳統(tǒng)中藥姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及心血管保護(hù)等多種生物學(xué)功能。盡管姜黃素的這些生物學(xué)作用的內(nèi)在機(jī)制并未闡明，但其抗氧化作用顯示為其最重要的核心作用。多項(xiàng)研究提示，在不同的心血管氧化損傷模型中，姜黃素可減少活性氧的生成以及減輕脂質(zhì)過氧化。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可減輕血管內(nèi)皮損傷，而對(duì)其內(nèi)在機(jī)制，并未闡明。自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)過程，主

2、要表現(xiàn)為分解長(zhǎng)壽蛋白以及循環(huán)利用細(xì)胞器。自噬誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)是自噬在真核細(xì)胞中的基本功能，然而，氧化應(yīng)激可引起過量的自噬從而導(dǎo)致疾病狀態(tài)。激活狀態(tài)的自噬可以是有益的，也可以是有害的。自噬在各種心臟疾病中起不同作用，激活有益的自噬是其用于心血管疾病治療的關(guān)鍵。誘導(dǎo)自噬抑制凋亡很可能是姜黃素抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。PI3 K/Akt/mTOR途徑是調(diào)節(jié)自噬在細(xì)胞存活、增殖和分化過程中的具有重要作用，mTOR是氨基酸、ATP和激素的受體，能夠抑制

3、自噬。營(yíng)養(yǎng)不良或者直接使用雷帕霉素可以抑制mTOR，由此可以激活A(yù)TG1，促進(jìn)自噬發(fā)生。通過調(diào)節(jié)mTOR通路，凋亡和自噬可以在多種細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整。
　　目的：以血管內(nèi)皮細(xì)胞EA-hy926細(xì)胞系為研究對(duì)象，通過H2O2干預(yù)構(gòu)建的細(xì)胞氧化損傷模型，觀察姜黃素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用及凋亡、自噬的影響，探討其中可能的相關(guān)機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。
　　方法：以200μmol/l H2O2處理EA-hy926內(nèi)皮細(xì)胞4

4、h，構(gòu)建心肌氧化損傷模型。并用姜黃素預(yù)處理4h，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率，Hoechst33258，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，JC-1評(píng)價(jià)線粒體膜電位，利用FITC-LC3熒光顯微鏡檢測(cè)自噬發(fā)生，同時(shí)應(yīng)用免疫印跡(Western Blotting)檢測(cè)凋亡、自噬相關(guān)蛋白以及通路蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：⑴與正常對(duì)照組相比較，姜黃素(0，5，10，20，30，40μmol/l)孵育細(xì)胞4小時(shí)，對(duì)細(xì)胞的生存率無(wú)明顯影響。而在此濃度

5、范圍內(nèi)，姜黃素孵育4小時(shí)后，與200μmol/lH2O2共孵育4小時(shí)，可顯著減輕H2O2對(duì)細(xì)胞生存率的影響，并且呈濃度依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑵與正常對(duì)照組相比，200μmol/l H2O2顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量，而姜黃素可減少H2O2引起的LDH含量的增加，即減輕H2O2引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激性死亡，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑶正常對(duì)照組顯示一定比例的紅色熒光以及綠色熒光;而CCCP作為線粒體電子傳遞鏈抑制

6、劑，干預(yù)后作為線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照，完全顯示為綠色熒光;200μmol/l H2O2干預(yù)組顯示有一定的紅色熒光，而綠色熒光較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng);10μmol/l姜黃素預(yù)處理后，綠色熒光較H2O2干預(yù)組減弱，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑷正常對(duì)照組，細(xì)胞存在一定比例的凋亡現(xiàn)象，200μmol/l H2O2干預(yù)組，可明顯增加凋亡細(xì)胞比例，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);姜黃素不同濃度的預(yù)處理，可不同程度減輕H2O2引起的細(xì)胞凋亡，

7、具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑸流式細(xì)胞儀以Annexin-Ⅴ(+)PI(-)標(biāo)示早期凋亡細(xì)胞，Annexin-Ⅴ(+)PI(+)標(biāo)示晚期凋亡和壞死細(xì)胞。正常對(duì)照組存在一定比例凋亡細(xì)胞，200μmol/lH2O2干預(yù)組，凋亡細(xì)胞比例明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);姜黃素預(yù)處理，5μmol/l姜黃素預(yù)處理組，凋亡細(xì)胞比例較H2O2干預(yù)組顯著減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而姜黃素濃度增加為20μmol/l，可進(jìn)一步

8、降低凋亡細(xì)胞的比例，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑹正常對(duì)照組存在一定的基礎(chǔ)水平的自噬，而雷帕霉素作為自噬誘導(dǎo)劑，其干預(yù)處理作為陽(yáng)性對(duì)照組，顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光;而H2O2干預(yù)，較之正常對(duì)照組，并沒有改變綠色熒光(P＞0.05)，姜黃素10μmol/l的預(yù)處理，顯著增加了綠色熒光強(qiáng)度，即增加自噬的發(fā)生，較之H2O2組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑺通過Western Blot凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，cleaved-c

9、aspase-3，Bcl-2，Bax的表達(dá)。H2O2干預(yù)后cleaved-caspase-3，Bax表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著減少，較之正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，姜黃素5μmol/l預(yù)處理可明顯減輕cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的改變，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，姜黃素20μmol/l預(yù)處理可進(jìn)一步增強(qiáng)此作用。通過Western Blot檢測(cè)LC3-Ⅱ/Ⅰ。姜黃素的預(yù)處理可以增加L

10、C3-Ⅱ的蛋白表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)，姜黃素20μmol/l的預(yù)處理較5μmol/l的預(yù)處理組，其促進(jìn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的作用進(jìn)一步增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通過Western Blot檢測(cè)P-Akt，P-mTOR蛋白的表達(dá)情況。H2O2的干預(yù)顯著增加了P-Akt，P-mTOR的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而姜黃素預(yù)處理可明顯減輕Akt，mTOR的磷酸化水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。