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1、目的:研究調(diào)脂顆粒對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vascular endothelialcell,HUVEC)在細胞、蛋白質(zhì)、分子水平自噬的影響,從而探討調(diào)脂顆??箘用}粥硬化的作用機制。
方法:運用血清藥理學(xué)方法,以調(diào)脂顆粒含藥血清處理生理狀態(tài)及病理狀態(tài)(過度自噬狀態(tài))下的肉皮細胞。通過MTT比色法檢測調(diào)脂顆粒含藥血清對內(nèi)皮細胞生長的影響。Western blot檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Be
2、clin-1的相對表達量變化,免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)目變化,SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因mTOR、ATG5、ATG7、Beclin-1的相對表達量變化。
結(jié)果:調(diào)脂顆粒含藥血清處理內(nèi)皮細胞后,較空白組,細胞活力無明顯改變,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的相對表達上調(diào),LC3自噬小體數(shù)量增加(p<0.05),Beclinl在分子及蛋白層面表達均無明顯差異(p>0.05)。雷帕霉素(Ra
3、pamycin,Rapa)處理內(nèi)皮細胞后,較空白組比較自噬相關(guān)蛋白及相關(guān)基因表達上調(diào)。調(diào)脂顆粒含藥血清聯(lián)合雷帕霉素處理HUVEC后,細胞活力無明顯改變,較雷帕霉素單獨處理比較,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的相對表達顯著下降,LC3自噬小體數(shù)量明顯減少(p<0.05或p<0.01),各自噬相關(guān)基因表達均上調(diào),Beclin-1在分子及蛋白層面表達均無明顯差異(p>0.05)。3MA(6-氨基-3-甲基嘌呤,3-Metllyladenine)聯(lián)合雷
4、帕霉素組與雷帕霉素組在各蛋白及分子水平存在明顯差異(p<0.05),但與各濃度調(diào)脂顆粒含藥血清聯(lián)合雷帕霉素處理組無明顯差異(p>0.05)。
結(jié)論:在蛋白及分子水平層面,調(diào)脂顆粒上調(diào)生理狀態(tài)下內(nèi)皮細胞自噬,抑制病理狀態(tài)下內(nèi)皮細胞自噬,驗證了調(diào)脂顆粒可促進內(nèi)皮細胞適度自噬,抑制內(nèi)皮細胞過度自噬,這可能是其抗動脈粥樣硬化的作用機制之一。各調(diào)脂顆粒藥物組與相關(guān)對照組的LC3表達存在差異,而Beclin1的表達無明顯差異,這說明調(diào)脂顆
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