腫瘤壞死因子-α誘導生成內皮細胞微粒的蛋白質組學研究.pdf

1、目的：
　　 ①制作適合蛋白質組學研究的離體活化血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)模型;
　　 ②研究經腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激后人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)蛋白質表達的變化與其生成的內皮細胞微粒(endothelial microparticle

2、，EMP)蛋白質組成的關聯;
　　 ③探討EMP所轉運的內皮細胞蛋白質在其與靶細胞相互作用過程中發(fā)揮的作用。
　　 內容：
　　 ①采用TNF-α激活HUVEC使其生成EMP，研究其量效和時效關系，制作離體的活化內皮細胞模型，并對EMP表型進行探討;
　　 ②運用蛋白質組學技術分析TNF-α刺激前后HUVEC蛋白質表達差異;
　　 ③運用蛋白質組學技術檢測TNF-α誘導生成的EMP蛋白質組成，通過

3、與TNF-α刺激前后HUVEC差異蛋白的比較，尋找共同蛋白，分析這些蛋白質的功能，探討內皮細胞活化過程中蛋白質轉運機制及EMP的功能。
　　 方法：
　　 ①體外培養(yǎng)原代HUVEC，予以不同反應濃度和作用時間的TNF-α刺激，誘導其生成并釋放EMP，同時以靜息狀態(tài)HUVEC作為正常對照。運用流式細胞術檢測EMP數量及其表面CD62E、CD31表達情況，對數據進行統計學分析。
　　 ②運用蛋白質組學中的2-DE和M

4、ALDI-TOF/TOF-MS技術比較分析TNF-α刺激前后HUVEC蛋白質表達的改變，尋找差異蛋白。
　　 ③運用蛋白質組學中的LC-MS/MS技術檢測鑒定TNF-α誘導生成的EMP蛋白質組成，將其與HUVEC差異蛋白進行比較，尋找共同蛋白。
　　 ④運用GO(gene ontology)和KEGG pathway對所發(fā)現的共同蛋白進行分析，獲得其分布和功能等方面的信息。
　　 結果：
　　 ①100n

5、g/ml TNF-α刺激HUVEC24h生成的EMP數量最多。反應濃度100ng/ml時TNF-α誘導產生的EMP數量與10ng/ml、200ng/ml的相比差異具有統計學意義(P＜0.05);作用時間24h時誘導產生的EMP數量與1h、3h的相比差異也具有統計學意義（P＜0.05）。
　　 ②反應24h時，TNF-α誘導產生的CD31+EMP數量及CD62E和CD31雙陽性EMP數量與EMP總數的差異均有統計學意義（P＜0.0

6、5），而CD62E+EMP數量與EMP總數的差異沒有統計學意義（P＞0.05）。
　　 ③2-DE技術顯示TNF-α刺激前后HUVEC共有47個差異蛋白質點，使用MALDI-TOF/TOF-MS技術成功鑒定其中29個差異蛋白，包括8個蛋白質刺激后上調、12個刺激后下調、8個刺激后不再表達、1個刺激后新表達。
　　 ④LC-MS/MS技術顯示TNF-α誘導產生的EMP包含83個蛋白質，與29個HUVEC差異蛋白比較后發(fā)現8

7、個共同蛋白。在經TNF-α刺激HUVEC中，這8個蛋白質中1個表現為不再表達，4個表現為刺激后下調，3個表現為刺激后上調。
　　 ⑤8個共同蛋白中包含了HUVEC上調的差異蛋白中表達量差異最大者heat shock protein beta-1，以及下調的差異蛋白中表達量差異最大者annexin A2。
　　 ⑥8個共同蛋白在炎癥反應、凝血反應、細胞凋亡、細胞增殖等方面具有重要作用。
　　 結論：
　　

8、①TNF-α刺激HUVEC生成EMP的數量與TNF-α的反應濃度和作用時間有關，100ng/ml TNF-α刺激HUVEC24h可產生較多數量EMP，以此為依據可制作適合蛋白質組學研究的離體活化VEC模型。
　　 ②CD62E+可用于TNF-α誘導生成EMP的表型鑒定。
　　 ③HUVEC經TNF-α刺激后29個蛋白質發(fā)生了表達量或表達種類的改變，而其生成的EMP蛋白質組成與這些蛋白質表達的改變有直接關聯。