EPO衍生肽HBSP抑制大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血-再灌注損傷的作用研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景及目的：
　　急性心肌梗死是全世界范圍內(nèi)致死及致殘的主要病因之一。對(duì)于急性心肌梗死的患者，及時(shí)的恢復(fù)梗死冠脈的血流灌注對(duì)于縮小心梗面積、保存左室收縮功能、防止心衰發(fā)生，改善預(yù)后具有重要意義。然而，再灌注本身可導(dǎo)致額外的心肌損傷，即缺血/再灌注損傷（I/RI）。I/RI可引起心肌收縮功能障礙及細(xì)胞損傷，抵消血管再通后血流恢復(fù)所帶來(lái)的臨床受益，目前尚無(wú)有效的防治措施。
　　促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，E

2、PO)作為一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞生成、刺激紅系造血的細(xì)胞活性因子，目前被廣泛地應(yīng)用于臨床上各種原因所致的貧血的治療。既往研究表明，除造血作用外，EPO還可對(duì)心臟、腎臟、大腦等多組織器官發(fā)揮保護(hù)作用。大量證據(jù)亦證明，EPO可減少缺血/再灌注相關(guān)的組織損傷，如心肌梗塞、出血性休克、急性腎損傷等。然而EPO本身的促紅細(xì)胞生成、促血栓形成等副作用極大地限制了其臨床應(yīng)用推廣。Brines等通過(guò)分析EPO的空間構(gòu)象，合成了一種可以和EPO組織保護(hù)受

3、體（EPOR-βcR）特異性結(jié)合的線性多肽鏈（Helix B-surface peptide，HBSP)，此多肽鏈由11個(gè)氨基酸殘基組成；在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型、大鼠中風(fēng)模型、嚙齒類動(dòng)物坐骨神經(jīng)擠壓傷等多個(gè)動(dòng)物模型中，此多肽均發(fā)揮了與EPO相似的組織保護(hù)作用，并且沒(méi)有EPO促紅細(xì)胞生成等不良反應(yīng)的發(fā)生。本課題組前期研究結(jié)果亦證實(shí)，HBSP可顯著抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷，減少梗死面積。但是HBSP對(duì)I/RI的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（C

4、MECs）是否具有保護(hù)作用及其可能涉及的機(jī)制并未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究旨在通過(guò)建立模擬缺血/再灌注模型，觀察 HBSP對(duì)于缺血/再灌注的CMECs是否有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其具體機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　分離培養(yǎng)大鼠 CMECs，建立模擬缺血/再灌注（SI/R)損傷模型，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）、模擬缺血/再灌注組（SI/R組）、模擬缺血/再灌注＋重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO,10 IU/ml）組、模擬缺血/再

5、灌注＋HBSP組；HBSP組分別選擇2.5、25、50、100ng/ml濃度，通過(guò)MTT比色法及TUNEL法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖能力及凋亡率，以確定藥物作用的最適濃度。確定最適濃度后采取細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，進(jìn)一步驗(yàn)證HBSP對(duì)于CMECs的作用。
　　為了研究HBSP的保護(hù)機(jī)制，我們將實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組（Con組）、模擬缺血/再灌注組（SI/R組）、模擬缺血/再灌注＋HBSP（最適濃度25ng/

6、ml）組、SI/R+HBSP+PI3K抑制劑LY294002組、SI/R+HBSP+Rapamycin組。其中mTOR為Akt下游分子，Rapamycin為其特異性抑制劑。采用Western blot法檢測(cè)Akt及磷酸化的Akt、mTOR及磷酸化的mTOR、p70S6K及磷酸化的p70S6K蛋白的表達(dá)，采取TUNEL法檢測(cè)CMECs的凋亡。
　　結(jié)果：
　　1、成功地分離和培養(yǎng)了心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并構(gòu)建了SI/R模型。

7、r>　　2、與對(duì)照組（Con組）相比較，SI/R組CMECs增殖能力明顯降低(P<0.01)，凋亡率顯著上升(3.54％±0.21% vs.41.1%±0.8%，P<0.01)，遷移能力下降。與SI/R組比，rhEPO組和HBSP組增殖能力明顯上升(P<0.05)，凋亡率顯著下降(P<0.01)，HBSP組遷移能力增強(qiáng)（P<0.01)。
　　3、用PI3K特異性抑制劑LY294002及mTOR特異性抑制劑Rapamycin分別對(duì)細(xì)

8、胞進(jìn)行干預(yù)后，結(jié)果顯示：與SI/R組相比，HBSP組Akt磷酸化水平、mTOR磷酸化水平及 p70S6K的磷酸化水平均顯著提高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01)；與SI/R+HBSP組相比，SI/R+HBSP+LY294002組Akt磷酸化水平、mTOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平均顯著下降（P<0.05)，SI/R+HBSP+Rapamycin組mTOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平顯著下降（P<0.05)。與