胰島素通過Akt-FoxO-SVV信號通路抑制缺血-再灌注損傷誘導的心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景：
　　急性心肌梗死是冠狀動脈阻塞導致該冠脈所供血區(qū)域心肌細胞壞死所致的一種臨床癥候群。心肌缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,I/RI)是急性心?；颊呷芩ê徒槿氲妊茉偻ㄖ委熯^程中常常伴隨出現(xiàn)的重要臨床現(xiàn)象,可導致患者病情惡化甚至死亡,因此如何抑制或減輕閉塞冠脈再通時伴隨出現(xiàn)的再灌注損傷,尋求一種積極、有效地保護性治療措施具有重要意義。有研究證實,在缺血/再灌注的損傷早期,心肌微血管

2、內(nèi)皮細胞的凋亡時間明顯早于心肌細胞,提示心肌微血管內(nèi)的皮細胞的凋亡是缺血/再灌注損傷發(fā)生的始動環(huán)節(jié)[1]。胰島素作為極化液的重要組成部分用于治療冠心病已有較長一段時間,既往研究表明,胰島素可通過“Akt/的eNOS/NO細胞生存信號機制”抑制 I/RI誘導的心肌細胞或血管內(nèi)皮細胞凋亡,發(fā)揮心臟保護作用[2,3],然而其是否能抑制 I/RI誘導的心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡及其相關(guān)機制少有報道。
　　FoxO1、FoxO3a是近年發(fā)現(xiàn)的F

3、oxO家族中的亞族,參與體內(nèi)多種病理生理過程,包括調(diào)節(jié)細胞代謝、調(diào)控細胞周期及凋亡等?！捌渲饕ㄎ辉诩毎藘?nèi),通過促進下游靶基因的表達導致細胞凋亡,而其磷酸化后則進入細的胞質(zhì),失去促凋亡的活性”[4,5],胰島素可調(diào)控FoxO家族中的部分分子,但在CMECs中是否能夠激活FoxO以及是哪個亞類分子在起作用尚不明確。
　　生存素(survivin,SVV)是近期發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis pro

4、tein,IAP)家族新成員,初步的研究多關(guān)注于其對腫瘤診斷、治療方面的作用,隨著研究的不斷深入,有學者發(fā)現(xiàn)它在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中也扮演重要角色,包括對損的傷血的管的修復、平滑肌細胞增殖調(diào)控等,我們在前期研究中已證實胰島素通過上調(diào)生存素表達,不僅可抑制 I/RI誘導的心肌細胞凋亡,并且對有顯著組織特異性的心肌微血管內(nèi)皮細胞也有保護作用,且其發(fā)揮保護作用可能與 SVV蛋白表達上調(diào)有關(guān)[6],但其相關(guān)分子機制是否與FoxO1/3a相關(guān)仍

5、不明確。
　　本實驗通過構(gòu)建CMECs的缺血/再灌注模型,觀察胰島素是否通過激活Akt/FoxO1或FoxO3a/SVV信號通路抑制I/RI誘導的CMECs凋亡。
　　研究目的：
　　1.觀察胰島素在抑制缺血/再灌注(I/R)損傷誘導的心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)凋亡中的保護作用。
　　2.探討胰島素保護CMECs作用是否與Akt/FoxO1或FoxO3a/SVV信號通路有關(guān)。
　　實驗方法：
　

6、　通過培養(yǎng)原代大鼠心肌微的血管內(nèi)皮細的胞并構(gòu)建模的擬缺血/再的灌注模型。隨機分為:
　　1)模擬缺血/再灌注組(SI/R);2)模擬缺血/再灌注+胰島素組(SI/R+Ins組);3)模擬缺血/再灌注+胰島素+Wortmannin組(SI/R+Ins+Wort組);4)模擬缺血/再灌注+胰島素+FoxO1 siRNA組(SI/R+Ins+FoxO1 siRNA組);5)模擬缺血/再灌注+胰島素+FoxO3a siRNA組(SI/R+

7、Ins+FoxO3a siRNA組)。各組分別選用胰島素、PI3K特異性抑制劑 Wortmannin以及 FoxO1/3a小干擾 RNA處理細胞。采用Western blot法檢測p-Akt(ser473)、p-FoxO1(ser256)、p- FoxO3a(Thr32)磷酸化水平及SVV蛋白的表達,TUNEL法檢測CMECs凋亡;ELISA法檢測Caspase-3活性,Transwell檢測細胞遷移能力。
　　實驗結(jié)果：

8、　　1.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細胞并成功構(gòu)建了模擬缺血/再灌注模型。
　　2.Transwell結(jié)果提示與 SI/R組比較,SI/R+Ins組細胞遷移較多(P<0.05);與SI/R+ Ins組相比較,SI/R+Ins+FoxO1siRNA組、SI/R+Ins+FoxO3a siRNA組細胞遷移明顯減少(P<0.05);Caspase-3活性及 TUNEL檢測結(jié)果提示,與 SI/R組相比較SI/R+Ins組細胞Caspase-3活

9、性降低,細胞凋亡減少(P<0.05);與SI/R+Ins組比較SI/R+Ins+FoxO1siRNA組、SI/R+Ins+FoxO3a siRNA組 Caspase-3活性增加,細胞凋亡明顯增多(P<0.05);
　　3.Western-blot結(jié)果提示與 SI/R組比較,胰島素可顯著上調(diào) CMECs的SVV蛋白表達(P<0.05);與 SI/R+Ins組相比較,再灌注加入 PI3K特異性抑制劑Wortmannin后,SVV蛋白表