放線菌素D-TNF-α誘導(dǎo)小鼠胰島微血管內(nèi)皮細胞凋亡的研究.pdf

1、胰島是高度血管化的微器官，胰島微血管內(nèi)皮細胞（islet microvascular endothelial cells，IMEC）是胰島微血管的主要組成部分，不僅具有血管內(nèi)皮細胞的一般性質(zhì)，如血管生成、止血的作用，而且擔負著營養(yǎng)β細胞、分泌誘導(dǎo)胰島細胞生長發(fā)育信號分子的功能。既往已有研究證明，β細胞功能衰竭很可能是胰島微血管病變的表現(xiàn)[2]，而過量的IMEC凋亡是引起胰島微血管病變的重要因素。正常的情況下，血管內(nèi)皮細胞的凋亡與生成處于

2、一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，但長期處于一種慢性的低度亞臨床炎癥狀態(tài)的2型糖尿病患者，尤其發(fā)生酮癥酸中毒、急性感染時，短時間內(nèi)啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致胰島微血管內(nèi)皮細胞大量凋亡，從而破壞動態(tài)平衡，抑制了血管的生成，最終導(dǎo)致β細胞損傷。據(jù)此，深入研究胰島內(nèi)皮細胞病理生理改變的機制，建立有效阻斷損傷通路的途徑，對于保護胰島細胞，阻止糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有積極意義。 為了更好地觀測炎癥起始細胞因子TNF-α、放線菌素D/TNF-α對IMEC的影響，

3、以及IMEC上TNFR1的表達和阻斷凋亡通路的機制，本試驗在建立小鼠IMEC凋亡模型的基礎(chǔ)上，以小鼠IMEC為研究對象，探討炎癥因子與胰島微血管內(nèi)皮細胞凋亡的關(guān)系，以期為防治糖尿病提供新的實驗依據(jù)。 目的: 研究腫瘤壞死因子1型受體（TNFR1）在小鼠IMEC上的表達，觀察TNF-α，ActD/TNF-α刺激對IMEC的作用及其可能的損傷機制，建立小鼠IMEC的凋亡模型，為干預(yù)糖尿病及尋找新的治療靶點提供實驗依據(jù)。

4、 方法: 1.以美國國立細胞庫（American Type Culture Collection，ATCC）MS-1細胞作為試驗對象進行培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡。將MS-1細胞置于含5%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。細胞貼壁生長，鋪滿后以0.25%胰酶消化傳代，每3d傳代1次。 2.細胞爬片及免疫熒光染色：細胞經(jīng)消化后，用含5%新生牛血清的培養(yǎng)基將細胞調(diào)成的細胞懸液，接種于6孔板中，待細胞生

5、長狀態(tài)良好時終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定爬片30 min后PBS沖洗，用0.1%Triton X-100處理后以正常羊血清工作液封閉，傾去血清，滴加一抗即兔抗鼠TNFR1多克隆抗體，過夜后滴加二抗即FITC標記羊抗兔IgG，室溫孵育2h。封片后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。 3.透射電鏡觀察：將細胞隨機分為3組：①正常對照組、②TNF-α組（TNF-α終濃度為100ng/ml，以下括號內(nèi)濃度均指終濃度）、③ActD/TNF-α組（在2

6、0ng/mlActD預(yù)處理15min后再加入TNF-α）。細胞經(jīng)藥物作用24h后，再用胰酶消化、PBS洗滌、離心、棄上清后以4%、PH7.4的戊二醛固定，雙鉛染色后置透射電鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化。 4.細胞毒實驗分為兩部分：將細胞接種于96孔板中，每孔100μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每組6個復(fù)孔。用不同濃度的TNF-α（每孔加100μl）37℃、5%CO2孵箱中刺激24小時后，每孔加MTT溶液（5g/l）2

7、0μl，37℃孵育4h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲亞楓（DMSO）振蕩10min，選擇570nm波長測吸光度以判斷細胞活力。同時，設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，比色時以空白孔調(diào)零。MTT自動比色法所測的吸光度反映細胞的損傷情況。 4.1 TNF-α體外對IMEC生長的細胞毒性作用 用不同濃度的TNF-α作用于對MS-1并觀察其對MS-1生長的影響。實驗分組：control組為正常對照組，細胞未經(jīng)任何處理；TN

8、F-α組加入不同濃度的TNF-α（20，40，80，100ng/ml）；ActD/TNF-α組在20ng/ml ActD預(yù)處理后加入與上組相對應(yīng)的濃度的TNF-α；作用24小時后，用MTT法檢測細胞毒作用， 4.2 Ac-DEVD-CHO拮抗ActD/TNF-α對IMEC的細胞毒作用 用MTT法檢測Ac-DEVD-CHO對ActD/TNF-α的拮抗作用。實驗分組：A組為正常對照組，細胞未經(jīng)任何處理；B組為僅加TNF-α（

9、100ng/ml）；C組為ActD（20ng/ml）預(yù)處理后加入TNF-α（100ng/ml）；D組為加入Ac-DEVD-CHO（200μmol/L）后15min加入ActD/TNF-α，孵育24h后，用MTT法檢測細胞毒作用。 5.流式細胞儀檢測細胞凋亡：將細胞接種于6孔板后，試驗分組：TNF-α組為僅加入TNF-α（100ng/ml）；Ac-DEVD-CHO組為僅加入Ac-DEVD-CHO（200μmol/L）；ActD/T

10、NF-α組為在ActD（20ng/ml）預(yù)處理后加入TNF-α（100ng/ml）；ActD/TNF-α/Ac-DEVD-CHO組再分3組，為分別加入不同濃度Ac-DEVD-CHO（50，100，200μmol/L）后15min加入ActD/TNF-α；正常對照組的細胞未經(jīng)任何處理。各組培養(yǎng)24h后用胰酶消化，冰PBS洗滌后加入Annexin V-FITC和PI染色，室溫避光孵育10 min，上機測試。每一實驗組檢測5份標本，Cellf

11、it軟件收集10000個細胞，Annexin V-FITC單染陽性的百分率即為細胞凋亡百分率。 結(jié)果: 1.免疫熒光染色后TNFR1在MS-1細胞呈較強黃綠色熒光，對照組無表達。 2.透射電鏡觀察可見正常對照組和TNF-α組細胞形態(tài)差別不明顯，多數(shù)為正常形態(tài)的細胞。ActD/TNF-α組以凋亡細胞為多，凋亡細胞膜空泡化，細胞體積明顯變小，細胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)混沌，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞膜融合而出芽，核膜清晰，可見大量凋亡小體。

12、 3.用20、40、80、100ng/ml TNF-α作用于MS-1細胞24h后，在20、40、80、100ng/ml TNF-α作用濃度下，ActD/TNF-α組的吸光度（OD值）依次為0.42±0.04、0.31±0.04、0.20±0.06、0.09±0.06，相同TNF-α濃度下TNF-α組的OD值依次為0.50±0.05、0.48±0.05、0.46±0.07、0.45±0.05。結(jié)果顯示ActD/TNF-α組OD值顯著低

13、于TNF-α組（在20ng/mlTNF-α組中，P=0.015；在40、80、100ng/mlTNF-α組中P=0.000）。Control組的OD值為0.50±0.05，與不同濃度TNF-α組的OD值兩兩相比無顯著差異（P>0.05）。Control組的OD值顯著高于不同濃度的ActD/TNF-α組（與20ng/ml ActD/TNF-α組相比P=0.025；與40、80、100ng/mlActD/TNF-α組相比P=0.000）。

14、 4.比較20、40、80、100ng/ml4個不同TNF-α濃度的ActD/TNF-α組的OD值顯示，MS-1細胞被ActD致敏15min后，其OD值與TNF-α濃度間存在顯著負相關(guān)關(guān)系（r=-0.923，P=0.000）。TNF-α作用濃度和干預(yù)因素之間存在交互效應(yīng)（F=12.083，P=0.000） 5.研究Ac-DEVD-CHO拮抗ActD/TNF-α對IMS-1細胞的細胞毒作用時顯示，TNF-α組、ActD/TN

15、F-α組、Ac-DEVD-CHO/ActD/TNF-α組于藥物作用24h后，TNF-α組、Ac-DEVD-CHO/ActD/TNF-α組的OD值分別為0.452±0.0630、0438±0.083，依次與正常對照組相比，均無顯著差異（P=0.618，0.620）。 6.研究Ac-DEVD-CHO對ActD/TNF-α誘導(dǎo)IMEC凋亡的保護作用時顯示，Ac-DEVD-CHO組、 TNF-α組的凋亡率分別為（11.13±1.13）%

16、、（11.39±1.09）%，分別與正常對照組相比，均無顯著差異（P=0.550和P=0.361）。 7.比較3個不同濃度的ActD/TNF-α/Ac-DEVD-CHO組的凋亡率后發(fā)現(xiàn)MS-1細胞的凋亡率與Ac-DEVD-CHO濃度間存在顯著負相關(guān)關(guān)系（r=-0.946，P=0.000），即MS-1細胞的凋亡率隨著Ac-DEVD-CHO濃度的升高而降低。 結(jié)論: 1、首次在小鼠胰島微血管內(nèi)皮細胞株MS-1上觀測到

17、TNF-α受體（TNFR1），并以ActD/TNF-α誘導(dǎo)MS-1細胞而建立IMEC的凋亡模型。 2、僅以TNF-α作用未引發(fā)MS-1細胞的形態(tài)學(xué)變化，但經(jīng)ActD預(yù)處理后細胞所發(fā)生的變化符合凋亡的形態(tài)學(xué)改變，且MS-1細胞在一定濃度范圍（20～100 ng/ml）TNF-α的作用下，隨著TNF-α作用濃度的增加，細胞活力逐漸下降，并在一定的范圍內(nèi)呈劑量.效應(yīng)關(guān)系。提示在胰島微血管內(nèi)皮細胞被致敏或其他條件下，炎癥因子TNF-α可