凋亡相關(guān)基因在放線菌素D誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及其在胃癌組織中的表達(dá)和臨床意義.pdf

1、目的：許多抗腫瘤化療藥物雖然結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同、作用靶點(diǎn)一不同，但都可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究通過(guò)觀察放線菌素D (ActD)對(duì)體外培養(yǎng)的胃腺癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡的影響及表達(dá)Survivin、HSP70和Cox-2的變化，探討ActD與胃腺癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系和ActD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。用基因芯片研究放線菌素 D 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)差異表達(dá)的基因。同時(shí)檢測(cè)了胃癌組織中Survivin、Cox-2和HSP-70的

2、表達(dá)，探討三者與胃癌發(fā)生發(fā)展的可能關(guān)系。 方法：應(yīng)用MTT觀察了ActD及其類似物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，應(yīng)用基因芯片、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡等技術(shù)檢測(cè)了ActD對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用及差異表達(dá)的基因；RT-PCR觀察了用藥前后胃癌細(xì)胞表達(dá)Survivin、Cox-2、HSP70等幾種凋亡相關(guān)基因的變化；構(gòu)建胃癌組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Survivin、Cox-2和HS

3、P-70在胃癌組織中的表達(dá)并對(duì)三者相關(guān)性及臨床意義進(jìn)行初步探討。 結(jié)果：1．濃度大于5.0×10<'-9>mol/l時(shí)，ActD對(duì)胃腺癌細(xì)胞的生存有顯著的影響，并呈劑量、時(shí)間依賴性，隨著藥物濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ActD對(duì)體外培養(yǎng)的BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用亦增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ActD類似物中[D-Phe<'2>，D-Me-Phe<'5>]<,2>AMD，[D-Phe<'2>，D-Me-Val<

4、'5>]<,2>，與母體對(duì)BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用相似，但是兩種類似物和母體相比較，對(duì)胃腺癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率在各作用時(shí)間內(nèi)、各濃度組中均略低于母體。 2．濃度為1.0×10<'-7>，5.0×10<'-8>mol/l時(shí)，ActD主要以細(xì)胞毒作用為主，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其主要表現(xiàn)為壞死峰；濃度為1.0×10<'-8>，5.0×10<'-9>，1.0×10<'-9>mol/l時(shí)，ActD作用72h后可誘導(dǎo)BGC82

5、3細(xì)胞發(fā)生凋亡，在G1期前出現(xiàn)明顯的凋亡峰，尤以5.0×10<'-9>mol/l最為顯著，凋亡率分別為 8.0％、28.0％、7.8％：當(dāng)作用時(shí)間小于72h時(shí)，僅有5.0×10<'-9>mol/l組出現(xiàn)明顯的凋亡峰，凋亡率為6.0％；ActD處理BGC823細(xì)胞大于24h(48h、72h)后，G1期含量則較對(duì)照組均有不同程度的升高，而G2、S期細(xì)胞含量均有不同程度的降低。 3．經(jīng)ActD(1.0×10<'-8>，5.0×10<'-9>m

6、ol/l)處理48h、72h后，胃腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，形成凋亡小體。 4．1.0×10<'-9>mol/l、5.0×10-9mol/l兩實(shí)驗(yàn)組Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組均降低，而且濃度較高組 survivin mRNA相對(duì)表達(dá)水平更低。5.0×10-9mol/1濃度實(shí)驗(yàn)組Cox-2和HSP70mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于濃度1.0×10-9mol/l實(shí)驗(yàn)組。 5．ActD處理胃癌BGC-823細(xì)胞后，

7、基因芯片篩選出差異表達(dá)的基因19條，其中16條表達(dá)上調(diào)，3條表達(dá)下調(diào)。主要是與DNA修復(fù)、免疫、凋亡、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)相關(guān)基因的差異表達(dá)。 6．Survivin、Cox-2和HSP70在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.6％(58/99)、60.6％(60/99)和61.6％(61/99)，三者陽(yáng)性表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度相關(guān)(P<0.05)，Cox-2和HSP70陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；Survivin和HSP

8、70在胃癌組織中共表達(dá)率為37.4％(37/99)，Survivin和Cox-2在胃癌組織中共表達(dá)率為35.4％(35/99)，Cox-2和HSP70在胃癌組織中共表達(dá)率為 41.4％(41/99)，三項(xiàng)指標(biāo)在胃癌中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；Kaplan-Meier生存曲線顯示三項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者的生存率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；單因素Cox回歸模型分析結(jié)果顯示，胃癌浸潤(rùn)深度、患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Cox-2蛋白

9、表達(dá)等四因素與患者預(yù)后有關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多因素Cox回歸模型分析結(jié)果僅見(jiàn)胃癌浸潤(rùn)深度、胃癌患者性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等三因素具有獨(dú)立的預(yù)后意義(P<0.05)；胃癌多因素Cox回歸模型風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)： h(t)=[h<,0>(t)]e<'(0.411X<,1>+0.635X<,3>+0.630X<,6>)>結(jié)論：1．高濃度組ActD主要以細(xì)胞毒作用對(duì)胃腺癌細(xì)胞造成直接殺傷致死作用，對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，且具有

10、時(shí)間和濃度依賴性；低濃度組ActD抑制胃腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，主要通過(guò)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)，低濃度組ActD對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響與細(xì)胞周期有一定關(guān)系；低濃度ActD可以使胃癌細(xì)胞Survivin、Cox-2和HSP70表達(dá)下調(diào)，提示Survivin、Cox-2和HSP70表達(dá)下調(diào)可能共同參與ActD誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。 2．ActD 類似物中[D-Phe<'2>，D-Me-Phe<'5>]<,2>AMD，[D-Phe

11、<'2>，D-Me-Val<'5>]<,2>AMD，對(duì)BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與母體相似，但抑制率低于母體，提示還需對(duì)ActD的結(jié)構(gòu)改造作進(jìn)一步研究。 3．ActD可以影響人胃癌BGC823細(xì)胞株凋亡等多個(gè)相關(guān)基因的差異表達(dá)。 4．Survivin、Cox-2和HSP70在胃癌中均有過(guò)度表達(dá)。Survivin過(guò)度表達(dá)可能主要參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的早期過(guò)程；Cox-2和HSP70與胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；胃癌浸潤(rùn)深度