多巴胺對背側(cè)紋狀體多棘神經(jīng)元β頻率共振雙向調(diào)節(jié)的離子機制和信號通路研究.pdf

1、研究背景：
　　大腦是一個高度分布式系統(tǒng)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的同步振蕩活動能將不同腦區(qū)在功能上聯(lián)系起來，實現(xiàn)多腦區(qū)的協(xié)同工作。基底神經(jīng)節(jié)（Basal ganglion，BG）-皮層環(huán)路廣泛存在β節(jié)律（13-30 Hz）的網(wǎng)絡(luò)振蕩并具有重要生理功能，帕金森病、亨廷頓病等多種神經(jīng)疾病均發(fā)現(xiàn)BG-皮層環(huán)路振蕩異常。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動的機制之一是神經(jīng)元的膜共振，即神經(jīng)元對某一特定頻率響應(yīng)尤其敏感的現(xiàn)象。皮層、海馬部位神經(jīng)元均存在共振現(xiàn)象并廣泛參與神經(jīng)

2、網(wǎng)絡(luò)振蕩節(jié)律的形成。既往研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體參與了BG-皮層環(huán)路中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩的形成，但是其具體機制目前尚不明確。前期研究表明，丘腦底核神經(jīng)元共振與BG-皮層環(huán)路中神經(jīng)振蕩密切相關(guān)，因此我們認(rèn)為紋狀體神經(jīng)元可能同樣存在共振現(xiàn)象并參與BG-皮層環(huán)路神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩，但目前背側(cè)紋狀體MSNs是否存在共振尚無報道。
　　作為BG的主要傳入核團，背側(cè)紋狀體與運動控制、執(zhí)行功能以及學(xué)習(xí)等生理過程相關(guān)。紋狀體投射神經(jīng)元為中等多棘神經(jīng)元（medium-

3、sized spiny neurons，MSNs），主要包括表達(dá)多巴胺D1受體的D1 MSNs及表達(dá)D2受體的D2 MSNs。D1 MSNs發(fā)出的纖維參與構(gòu)成直接通路，D2 MSNs發(fā)出的纖維參與構(gòu)成間接通路。生理情況下，多巴胺通過 D1及 D2受體維持兩條通路功能動態(tài)平衡。由于膜共振參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電以及樹突整合過程，因此多巴胺可能通過改變MSNs共振特性影響紋狀體神經(jīng)元放電模式或樹突整合功能進而導(dǎo)致直接通路與間接通路之間出現(xiàn)功能失衡

4、，但其具體機制目前尚不明確。
　　本課題選擇背側(cè)紋狀體MSNs作為研究對象，利用D1-Tdtamato和D2-eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠活體區(qū)分D1 MSNs及D2 MSNs，研究其共振現(xiàn)象及離子機制，并深入探討多巴胺對直接通路及間接通路MSNs共振的調(diào)節(jié)作用的離子機制與信號通路，結(jié)果將有助于進一步揭示BG-皮層環(huán)路中網(wǎng)絡(luò)振蕩的形成機制和潛在的病理調(diào)節(jié)作用。
　　實驗?zāi)康模?br>　?。?）研究背側(cè)紋狀體兩類MSNs是否有共振現(xiàn)象及

5、其特征；
　　（2）探討兩類MSNs共振的離子機制；
　?。?）研究多巴胺D1、D2受體對兩類MSNs Kir電流的影響及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；
　　（4）探討多巴胺受體對兩類MSNs膜共振及突觸傳遞功能的影響。
　　實驗方法：
　　（1）腦片準(zhǔn)備及電生理記錄
　　使用D1-Tdtomato及D2-eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠（4-6周），制作含有紋狀體的冠狀腦片（厚300μm），根據(jù)熒光確定D1或D2 MSN，進行全

6、細(xì)胞記錄。選擇串聯(lián)電阻小于20 MΩ、靜息電位負(fù)于-60 mV、動作電位有超射的神經(jīng)元進行記錄。
　?。?）MSNs共振的記錄及分析
　　在全細(xì)胞電流鉗模式下，將細(xì)胞鉗制于不同膜電位（-70mV、-100mV及-120mV），給予細(xì)胞一個振幅固定、頻率隨時間線性增大的正弦電流（ impedance amplitude profile，ZAP）刺激（時程10s，頻率0-200Hz），記錄神經(jīng)元的電壓反應(yīng)。如神經(jīng)元在某一個特定頻

7、段電流刺激的電壓反應(yīng)最強，即代表出現(xiàn)共振現(xiàn)象，此時在該頻段電壓表現(xiàn)出明顯的共振峰，此共振峰所對應(yīng)的頻率即為神經(jīng)元的共振頻率（fres）。將實驗中記錄到的電壓反應(yīng)與ZAP電流進行FFT后相除得到阻抗曲線，讀出fres及阻抗值。
　?。?）MSNs樹突時間整合的記錄及分析
　　將刺激電極放置于胼胝體內(nèi)側(cè)靠近背側(cè)紋狀體邊緣的位置。在電流鉗模式下將細(xì)胞鉗制于-70mV，利用電刺激器和隔離器通過輸出一個恒定電流作用于MSNs。此電流由

8、5個時長為100μs、頻率40Hz的脈沖構(gòu)成，可以誘發(fā)出頻率為40Hz的5個連續(xù)的EPSP。以第5個EPSP幅度與第1個EPSP幅度的比值作為衡量樹突時間整合的標(biāo)準(zhǔn)。
　?。?）MSNs樹突空間整合的記錄及分析
　　利用LabView7.0圖形化編程軟件產(chǎn)生一個隨機的噪聲刺激電流（時長10s，濾波50KHz），電流刺激強度為基強度的1.5-2.0倍。觀察此強度下細(xì)胞對噪聲刺激的放電反應(yīng)，計算即時放電頻率，以此作為評估神經(jīng)元樹

9、突空間整合的指標(biāo)。
　?。?）給藥方式
　　除DL-AP5（NaOH，1eq）以及Quinpirole（去離子水）外，其余藥品均使用DMSO作為溶劑配制。儲存濃度為終濃度的1000倍，使用時按1:1000比例加入外液，DMSO終濃度小于0.1％。某些試驗中，neurobiotin350及Adenosine加入電極內(nèi)液。
　　（6）統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS19.0進行分析，實驗結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SEM）表

10、示。兩組間均數(shù)的比較采用單樣本t檢驗或者配對樣本t檢驗。多組間的數(shù)據(jù)用One-way ANOVA或Two-way ANOVA進行比較，兩兩之間用LSD方法進行比較，如P<0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果：
　　（1）MSNs的閾下膜共振及其電壓依賴性
　　在28℃條件下，分別將細(xì)胞膜電位鉗制于-70mV、-100mV及-120mV，給予ZAP電流刺激。靜息狀態(tài)下（-70mV）未記錄到共振峰。當(dāng)膜電位超級化至-

11、100mV時， MSN電壓出現(xiàn)共振峰，有膜共振現(xiàn)象產(chǎn)生。鉗制電位為-120mV時，MSN電壓反應(yīng)呈明顯梭型，共振現(xiàn)象較-100mV更加明顯。當(dāng)膜電位超級化幅度逐步增大時，共振頻率逐步升高（-70mV,0 Hz, n=3；-100 mV,11.7±0.39 Hz，n=5；-120 mV,17.8±0.60 Hz, n=5），共振幅度逐步減?。?70mV，101.0±12.66 MΩ，n=3；-100 mV，68.4±12.8 MΩ，n=5

12、；-120 mV,49.7±6.39 MΩ，n=5）。
　　鉗制電位為-100mV時，兩類MSNs記錄到明顯共振峰，共振頻率位于10-20Hz之間（D1 MSNs：15.3±0.56 Hz；D2 MSNs：14.5±0.67 Hz），均屬于β頻段。D1及D2 MSNs之間在共振阻抗及fres方面均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　?。?）MSNs共振由Kir電流介導(dǎo)
　　膜電位超級化時D1 MSNs及D2 MSNs均被誘導(dǎo)出快速激活的

13、內(nèi)向離子流。此電流具有明顯的內(nèi)向整流特性，可被BaCl2阻斷，結(jié)合以往研究，表明所記錄的電流為Kir電流。兩類MSNs之間Kir電流幅度及衰減時間無統(tǒng)計學(xué)差異。阻斷Kir電流后兩類MSNs共振均消失。Kir的幅度受細(xì)胞外K+濃度調(diào)節(jié)，細(xì)胞外K+濃度升高時，Kir幅度增大，細(xì)胞fres也隨之升高。
　?。?）多巴胺對兩種類型MSNs Kir電流及共振具有雙向調(diào)節(jié)作用
　　多巴胺D1受體激活后D1 MSN Kir電流幅度增大，共

14、振峰右移，fres增大，共振幅度減小，阻斷D1受體后上述作用消失。D2受體激活后D2 MSN Kir電流幅度減小，共振峰左移，fres降低，共振幅度增大，阻斷D2受體后上述作用消失。多巴胺受體激動劑對D1及D2 MSNs共振及Kir電流的作用是可逆的，不會被膽堿能M1及M4受體阻斷劑所阻斷。預(yù)先阻斷Kir電流后，D1及D2受體激動劑對電流及共振的調(diào)節(jié)作用均消失。
　?。?）多巴胺對MSNs樹突時間整合的影響
　　加入D1受體

15、激動劑SKF83822后刺激電極誘發(fā)的EPSP幅度與加藥前相比降低,第5個EPSP幅度與第1個EPSP幅度的比值降低（加藥前：1.4±0.10；SKF83822：1.2±0.07;n=7,P<0.01）。應(yīng)用Quinpirole孵育D2 MSN后，各個EPSP幅度均不同程度增大，第5個EPSP幅度與第1個EPSP幅度的比值明顯升高（加藥前：1.4±0.21；Quinpirole：1.9±0.42, n=7, P<0.05）。SKF838

16、22及Quinpirole對第一個EPSP幅度均無明顯影響。
　?。?）多巴胺對MSNs樹突空間整合的影響
　　膜電位為-70mV時，兩類MSNs均出現(xiàn)隨機放電，平均即時放電頻率均在13Hz左右，與MSNs共振頻率同屬β頻段。應(yīng)用SKF83822孵育細(xì)胞后，D1 MSNs放電頻率并沒有明顯改變（加藥前：13.3±1.76 Hz；SKF83822,13.7±2.06 Hz；n=5, P>0.05）。但是SKF83822使D1

17、MSNs基強度降低。當(dāng)依照新的刺激強度給予噪聲刺激時，D1 MSNs放電頻率明顯降低（加藥前：13.9±1.31 Hz；SKF83822：13.9±1.75 Hz；SKF83822（新強度）：7.5±1.2 Hz, n=6;P<0.001）。
　　應(yīng)用Quinpirole孵育D2MSNs后，-70mV時細(xì)胞放電頻率明顯增加（加藥前，12.7±1.49 Hz；Quinpirole，17.8±1.65 Hz；n=8，P<0.01）。<

18、br>　?。?）多巴胺調(diào)節(jié)MSNs Kir電流的分子機制
　　激活PKA通路可模擬D1受體激活后增強D1 MSN Kir電流的效應(yīng)，PKA通路阻斷劑則可阻斷D1受體激動劑的作用。激活PKC通路可模擬D2受體激動劑抑制D2 MSN Kir電流的效應(yīng)，而阻斷PKC通路及PLC通路均可以阻斷D2受體激動劑的作用。細(xì)胞內(nèi)PIP2含量減少后，D1受體及D2受體對Kir電流的調(diào)節(jié)作用均消失。
　　結(jié)論:
　　本課題利用轉(zhuǎn)基因小鼠及

19、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，首次對背側(cè)紋狀體MSNs共振特性、離子機制以及DA對MSNs共振特性的調(diào)節(jié)進行了研究。實驗結(jié)果證實：背側(cè)紋狀體MSNs存在由Kir電流介導(dǎo)的β節(jié)律共振，此共振具有電壓依賴性及細(xì)胞外K+濃度依賴性。D1受體通過cAMP-PKA通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，使D1 MSNs Kir電流幅度增加，共振頻率提高，共振幅度降低，樹突整合能力下降；D2受體通過PLC-PKC通路使D2 MSNs Kir電流幅度減小，共振頻率降低，共振幅度增高，