丘腦底核神經(jīng)元的共振及其和多巴胺受體的關(guān)系.pdf

1、研究背景：
　　大腦是一個高度分布式系統(tǒng)，不同感知信息在大腦的不同腦區(qū)得到處理和并行執(zhí)行，但并沒有一個統(tǒng)一的協(xié)調(diào)中心負(fù)責(zé)管理不同腦區(qū)功能的協(xié)調(diào)。大腦的“同步振蕩”活動被認(rèn)為是“捆綁”一些空間上分隔，但又彼此相關(guān)的神經(jīng)信息的機(jī)制之一，可協(xié)助大腦實現(xiàn)多腦區(qū)的協(xié)同工作。目前普遍認(rèn)為神經(jīng)元共振是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動的重要基礎(chǔ)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)皮層和海馬等部位神經(jīng)元均存在共振現(xiàn)象，并證實這些細(xì)胞的共振參與了振蕩節(jié)律的形成，具有重要生理功能。但對基底節(jié)（

2、BG）各核團(tuán)神經(jīng)元共振特性的研究還處于空白狀態(tài)，研究BG各核團(tuán)神經(jīng)元的共振及其機(jī)制，有可能幫助我們深入認(rèn)識BG系統(tǒng)調(diào)節(jié)運(yùn)動功能的電生理機(jī)制。
　　帕金森?。≒D）等病理條件下，BG的異常同步振蕩可通過神經(jīng)投射通路影響大腦皮層，導(dǎo)致皮層感覺運(yùn)動區(qū)活動異常，從而錯誤地“捆綁”了多腦區(qū)的運(yùn)動信息，造成本該協(xié)同工作的肌肉群發(fā)生紊亂，導(dǎo)致相應(yīng)的臨床癥狀。目前，BG-皮層環(huán)路的異常同步振蕩已成為PD的新病理機(jī)制，但發(fā)生異常振蕩的機(jī)理仍不清。神

3、經(jīng)元共振是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩活動的重要基礎(chǔ)，故研究BG各核團(tuán)神經(jīng)元的共振現(xiàn)象及其和PD的關(guān)系意義重大，有可能在PD發(fā)生的電生理機(jī)制方面有所突破。
　　丘腦底核（STN）在PD的形成發(fā)展過程中起了重要作用，是臨床DBS治療PD的主要靶核之一。目前已證實黑質(zhì)致密部和STN間存在直接的多巴胺能纖維聯(lián)系，多巴胺可通過STN神經(jīng)元表面的多巴胺受體直接作用于其神經(jīng)元。故本課題首先選取STN作為研究對象，研究其共振現(xiàn)象及機(jī)制，并深入研究該神經(jīng)元共振和

4、多巴胺受體的關(guān)系。
　　實驗?zāi)康模?br>　　（1）研究STN神經(jīng)元是否有共振現(xiàn)象并研究其常規(guī)特性；
　　（2）探索STN神經(jīng)元共振的離子機(jī)制；
　　（3）分別研究多巴胺D1、D2受體阻斷劑對STN神經(jīng)元共振特性的影響及其和超極化激活的陽離子流（Ih）的關(guān)系；
　?。?）初步探索多巴胺受體阻斷劑影響STN神經(jīng)元共振的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　實驗方法：
　?。?）腦片準(zhǔn)備及鉗制細(xì)胞
　　異氟烷吸入麻醉

5、后斷頭處死大鼠（13-18天，雄性），迅速取腦，置于予充混合氧（95％O2，5％CO2）的冰浴人工腦脊液（ACSF）中，振動切片機(jī)切取含STN的腦片（350-400μm），在ACSF中孵育（34℃）1小時，以恢復(fù)腦片狀態(tài)，將腦片移至記錄浴槽，用氧飽和的ACSF持續(xù)灌流(2ml/min)。開啟浴槽加熱系統(tǒng)，使腦片溫度維持在34℃。鏡下定位核團(tuán)并選取活性較好的細(xì)胞，常規(guī)鉗制細(xì)胞形成全細(xì)胞模式，所用玻璃微電極電阻3-7MΩ。讓細(xì)胞恢復(fù)約5分鐘

6、后，利用細(xì)胞的電生理特征鑒定細(xì)胞并測試細(xì)胞膜電位、動作電位等常規(guī)參數(shù)，選擇串聯(lián)電阻在10-20MΩ，靜息電位負(fù)于-55mV，同時動作電位超射較好的神經(jīng)元進(jìn)行實驗。
　?。?）神經(jīng)元共振特性測試
　　在全細(xì)胞電流鉗模式下，先用直流電將細(xì)胞鉗制于目標(biāo)電壓（-50mV，-60mV，-70mV，-80mV及-90mV），通過記錄電極給予細(xì)胞一個振幅固定、頻率隨時間線性增大的正弦電流（ZAP）刺激，記錄神經(jīng)元的電壓反應(yīng)。共振表現(xiàn)為神經(jīng)

7、元膜電壓在某個特定的頻段出現(xiàn)一個可重復(fù)的凸起——共振峰，共振峰所對應(yīng)的頻率即為細(xì)胞的共振頻率(fres)。為了量化共振的強(qiáng)度，將共振峰的阻抗值與0.5Hz對應(yīng)的阻抗值的比值作為衡量共振強(qiáng)度的指標(biāo)，稱為Q值。調(diào)整ZAP電流強(qiáng)度使其引起的電壓反應(yīng)峰—峰值控制在±10mV以內(nèi)，以免誘發(fā)動作電位，必要時可適當(dāng)使用河豚毒素（TTX）。為了方便測量fres及Q值，將記錄到的電壓反應(yīng)和輸入的ZAP電流進(jìn)行快速傅立葉變換(FFT)，計算阻抗值(Z)，公

8、式為：Z=FFT(V)/FFT(I)，繪制阻抗曲線，在阻抗曲線上很容易讀出fres并計算出Q值。為了排除刺激的時間依賴性對細(xì)胞共振峰的影響，給予反向ZAP電流（時程20s，頻率18-0Hz）刺激，觀察細(xì)胞的電壓反應(yīng)與正常ZAP刺激結(jié)果是否一致。
　?。?）神經(jīng)元放電的頻率選擇性測試
　　在全細(xì)胞電流鉗模式下，先用直流電將細(xì)胞鉗制于目標(biāo)電壓（-70mV），通過調(diào)節(jié)增益水平逐漸加大ZAP電流的幅度，直至剛剛出現(xiàn)動作電位，觀察細(xì)胞

9、放電所對應(yīng)的頻段。為了排除放電的時間及波形依賴性，換一種刺激方式，給予不同頻率的等幅恒頻的正弦電流刺激，同法觀察細(xì)胞的優(yōu)先放電頻率。
　　（4）神經(jīng)元Ih的記錄
　　鉗制細(xì)胞形成全細(xì)胞模式并待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，在全細(xì)胞電壓鉗模式下，給予一串超極化step電壓刺激，記錄膜電流，Ih表現(xiàn)為一緩慢激活的內(nèi)向電流。
　　（5）Ih在STN神經(jīng)元閾下共振及放電頻率選擇性中的作用
　　在外液中給予Ih特異性阻斷劑ZD7288(

10、20μM)，觀察給藥前后STN神經(jīng)元閾下共振及放電頻率選擇性的變化。
　　（6）不同多巴胺受體阻斷劑對STN神經(jīng)元共振的影響
　?、俜謩e給予氯氮平（Clozapine，50μM）、氟哌啶醇（Haloperidol，30μM）、SCH-23390(1μM)、舒必利（Sulpiride，1μM）等不同亞型多巴胺受體的阻斷劑，觀察給藥前后STN神經(jīng)元共振特性的變化，研究其對STN神經(jīng)元共振特性的影響。
　?、谇懊鎸嶒炞C實D2

11、受體特異性阻斷劑Sulpiride可阻斷STN神經(jīng)元的共振現(xiàn)象，但D1受體特異性阻斷劑SCH-23390對共振無顯著影響。故我們進(jìn)一步研究Sulpiride對Ih的影響，探索其影響共振的離子機(jī)制，并研究其對STN神經(jīng)元放電頻率選擇性的影響。
　　（7）Sulpiride影響STN神經(jīng)元的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初探
　?、侔聪卤矸纸M、加藥（n=10）
　?、谥饕^察指標(biāo)有：神經(jīng)元閾下共振特性、神經(jīng)元放電的頻率選擇性。鉗制細(xì)胞形成全

12、細(xì)胞模式后等20min左右，待GDP-β-S、GTP-γ-S、GTP等藥物擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi)、有效作用于細(xì)胞后再開始實驗，方法同前。
　?。?）所記錄神經(jīng)元的定位及形態(tài)學(xué)觀察
　　隨機(jī)抽取部分神經(jīng)元(15個)行熒光黃標(biāo)記染色，用含熒光黃的電極內(nèi)液(1.5‰)在避光條件下鉗制細(xì)胞，常規(guī)行電生理記錄，留置電極30min以上，熒光光源下觀察神經(jīng)元形態(tài)，確認(rèn)染色充分后，緩慢退出電極。將腦片切掉一角并記錄，以標(biāo)記正反面，在4％多聚甲醛中避光

13、固定。將甲醛固定過的腦片鋪于載玻片上，有標(biāo)記細(xì)胞的一面朝上，熒光封片液、指甲油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
　　（9）統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS13.0進(jìn)行分析，實驗結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。各組間的數(shù)據(jù)用One-wayANOVA或Two-wayANOVA進(jìn)行比較，兩兩之間用LSD方法進(jìn)行比較，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，如P<0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果：
　?。?）STN神經(jīng)

14、元的形態(tài)學(xué)定位及電生理鑒定
　　激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光黃標(biāo)記的STN神經(jīng)元，低倍鏡下證實實驗所選細(xì)胞均位于STN，高倍鏡下可見神經(jīng)元胞體、軸突清晰可見，形態(tài)符合STN神經(jīng)元特征。電壓鉗下給予一串超極化Step電壓刺激，可見明顯Ih及尾電流。電流鉗下給予一串外向電流刺激，使細(xì)胞超極化，記錄細(xì)胞的電壓反應(yīng)，其主要特征有刺激起始段的“Sag”、刺激末伴隨動作電位的反跳去極化及動作電位后的平臺電位，符合STN神經(jīng)元的電生理特性。

15、>　?。?）STN神經(jīng)元的閾下膜共振
　　在34℃條件下，將細(xì)胞鉗制于-70mV水平，給予ZAP電流刺激，記錄到的電壓反應(yīng)呈梭形，在2.5-3Hz頻段，電壓反應(yīng)顯著增強(qiáng)，證實細(xì)胞存在共振現(xiàn)象。將數(shù)據(jù)做快速傅立葉變換，繪制阻抗曲線，可見該細(xì)胞fres亦在2.5-3Hz頻段。統(tǒng)計分析示神經(jīng)元共振的fres和Q值分別為2.67±0.29Hz和1.093±0.0202(n=8)。反向ZAP電流刺激產(chǎn)生的電壓反應(yīng)較上述結(jié)果無明顯差異(P>0

16、.05,n=6)。
　?。?）STN神經(jīng)元共振的溫度依賴性
　　將細(xì)胞鉗制于-70mV水平，在30℃、34℃、38℃三個不同溫度水平觀察STN神經(jīng)元的共振特性。神經(jīng)元fres隨溫度升高而升高，統(tǒng)計數(shù)據(jù)示：神經(jīng)元fres在30℃、34℃、38℃條件下分別為1.99±0.36Hz、2.67±0.29Hz、4.07±0.40Hz，經(jīng)單因素方差分析統(tǒng)計三組間統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05，n=8)。
　?。?）STN神經(jīng)元共振的

17、電壓依賴性
　　在-60mV到-90mV水平神經(jīng)元對ZAP電流的電壓反應(yīng)呈梭形，共振明顯。fres隨電壓的超極化而升高，可從-60mV時的2.01±0.25Hz升高到-90mV時的3.09±0.32Hz，經(jīng)方差分析統(tǒng)計各組間統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05，n=10)。Q值亦有顯著電壓依賴性，-60mV、-90mV時其水平較低，-70mV條件下Q值最大，達(dá)1.092±0.021。-50mV條件下神經(jīng)元對ZAP電流的電壓反應(yīng)呈喇叭口狀，

18、無明顯共振現(xiàn)象。
　　（5）STN神經(jīng)元放電的頻率選擇性
　　給予ZAP電流證實STN神經(jīng)元存在閾下共振后，逐漸加大ZAP電流的幅度，直至剛剛出現(xiàn)動作電位，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞最先出現(xiàn)放電的頻段和其fres一致。換一種刺激方式，給予不同頻率的等幅恒頻的正弦電流刺激，結(jié)果亦證實細(xì)胞最先出現(xiàn)放電的頻段與fres一致。
　　（6）抑制Ih可阻斷STN神經(jīng)元的閾下共振及其放電頻率選擇性
　　在全細(xì)胞電壓鉗模式下，Ih表現(xiàn)為一緩慢激活

19、的內(nèi)向電流，在各電位水平均可被ZD7288顯著抑制（P<0.05，n=12）。生理條件下神經(jīng)元存在共振現(xiàn)象，放電的頻率選擇性明顯，給予ZD7288阻斷Ih后，記錄的電壓反應(yīng)變?yōu)槔瓤跔?，共振消失、神?jīng)元放電的頻率選擇性也同時消失。統(tǒng)計分析顯示ZD7288消除共振及放電頻率選擇性的有效率均可達(dá)100％(n=10)。
　?。?）多巴胺受體阻斷劑對STN神經(jīng)元閾下共振的影響
　　外液中加入Clozapine(50μM)或Halop

20、eridol(30μM)同時阻斷D1、D2受體后，神經(jīng)元對ZAP的電壓反應(yīng)呈喇叭口狀，共振現(xiàn)象被消除。外液中加入Sulpiride單純阻斷D2受體效果類似。統(tǒng)計分析顯示Clozapine、Haloperidol及Sulpiride消除共振的有效率均可達(dá)100％(n=10)。外液中加入SCH-23390單純阻斷D1受體，STN神經(jīng)元閾下共振未見明顯改變（P>0.05，n=10）。
　?。?）Sulpiride對STN神經(jīng)元放電頻率選