肝X受體-α對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)與神經(jīng)元衍生孤核受體-1的關(guān)聯(lián).pdf

1、目的:通過體外細(xì)胞試驗(yàn),探討肝X受體-α(LXRα)抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠枯否細(xì)胞(KCs),炎癥反應(yīng)途徑與神經(jīng)元衍生孤核受體-1(NOR-1)的關(guān)系。
　　 方法:用密度梯度離心法分離雄性KM小鼠肝臟中的KCs,并將獲得的細(xì)胞用含20％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后隨機(jī)分為四組:(1)對(duì)照組:不含血清的RPMI1640培養(yǎng)30h。(2)LPS處理組:不含血清的RPMI1640培養(yǎng)24h,再以含10μg/ml

2、 LPS的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。(3)T0901317組:不含血清的RPMI1640培養(yǎng)6h后,再以T0901317終濃度為1μM的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。(4)LPS+T0901317組:以T0901317終濃度為1μM的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,再用含10μg/ml LPS的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測各組細(xì)胞的LXRα和NOR-1的mRNA表達(dá)水平；Western blotting及免

3、疫細(xì)胞熒光染色檢測各組細(xì)胞的LXRα和NOR-1的蛋白表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組上清液的TNF-α和IL-10含量。
　　 結(jié)果:(1)Real-Time PCR結(jié)果顯示:LXRαmRNA在聯(lián)合處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2-△△CT＞2,結(jié)果有顯著性差異；LXRαmRNA在T0901317處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2-2-△△CT＞2,結(jié)果有顯著性差異；其在空白組中的表達(dá)量高于LPS處理組,其2-△△CT＞

4、2,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NOR-1 mRNA在聯(lián)合處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2-△△CT＞2,結(jié)果有顯著性差異；NOR-1 mRNA在T0901317處理組中表達(dá)量高于LPS處理組,其2-△△CT＞2,結(jié)果有顯著性差異；其在空白組中的表達(dá)量高于LPS處理組,其2-△△CT＞2,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)Western blot檢測結(jié)果顯示:LXRα及NOR-1蛋白為單一條帶,其相對(duì)分子質(zhì)量分別為50kDa、60kDa,用內(nèi)參照對(duì)待測

5、物灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。LPS組LXRα和NOR-1表達(dá)最低(其值分別為0.569±0.046和0.335±0.042),明顯低于其它三組(對(duì)照組分別為:1.014±0.050和0.541±0.017,聯(lián)合處理組分別為:1.232±0.027和0.819±0.022,T0901317處理組分別為:1.736±0.039和1.031±0.040),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與其它三組相比,LXRα和NOR-1蛋白表達(dá)都在T0901

6、317處理組最高(P＜0.05):LPS處理組中,LXRα及NOR-1蛋白表達(dá)都低于對(duì)照組(P＜0.05)。(3)免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示:LXRα陽性細(xì)胞為胞漿及胞核內(nèi)綠色熒光顆粒,NOR-1陽性細(xì)胞為胞漿及胞核內(nèi)紅色熒光顆粒。LXRα熒光染色強(qiáng)度在對(duì)照組、T0901317處理組、LPS處理組及聯(lián)合處理組分別為(97.52±10.39;110.04±14.54；56.98±7.95；105.58±14.03):NOR-1染色強(qiáng)度在對(duì)照

7、組、T0901317處理組、LPS處理組及聯(lián)合處理組分別為(80.15±4.88:115.65±8.47；65.50±5.76；94.14±4.48),表示其蛋白表達(dá)水平在T0901317組最高(P＜0.05),在LPS處理組最低(P＜0.05)。此結(jié)果與western結(jié)果相符。(4)ELISA結(jié)果顯示:腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)在LPS處理組的含量(450.89±78.52)顯著高于對(duì)

8、照組(5.84±2.35)及T0901317處理組(6.73±1.90),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；聯(lián)合處理組TNF-α含量(61.21±17.45)比LPS處理組明顯降低(P＜0.05)。白介素-10(Interleukin-10,IL-10)在聯(lián)合處理組的含量(537.41±36.41)顯著高于對(duì)照組(10.67±3.48)及T0901317處理組(10.17±1.82),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；聯(lián)合處理組IL

9、-10含量比LPS處理組(61.85±12.41)明顯提高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)用T0901317處理后,LXRα和NOR-1的表達(dá)都明顯增加,LPS所誘生的炎癥因子TNF-α大大降低,而抑炎因子IL-10含量大大增加。相對(duì)于對(duì)照組及T0901317處理組,在經(jīng)過LPS處理后,LXRα和NOR-1的表達(dá)都有降低,TNF-α表達(dá)明顯上升,IL-10表達(dá)明顯下降。因此,LXRα與NOR-1存在著相互依賴的