慢性阻塞性肺疾病中轉(zhuǎn)錄因子ATF3-ATF4和KLF2在Nrf2-γ-GCS通路中的作用及意義.pdf

1、【目的】研究轉(zhuǎn)錄因子ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2及γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠及患者肺組織中的表達(dá)變化關(guān)系;探討 ATF3、ATF4、KLF2與Nrf2蛋白之間的相互作用,以及對(duì)γ-GCS-HS基因表達(dá)的影響;探索它們?cè)贑OPD發(fā)病中的可能作用,為COPD的防治提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】實(shí)驗(yàn)分兩部分。(1)動(dòng)物試驗(yàn)部分:將22只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和COPD模型組,每組11只。采用每

2、日熏香煙和兩次氣管內(nèi)滴入脂多糖(LPS)復(fù)制 COPD大鼠模型。檢測(cè)各組大鼠肺功能并觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變;原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肺組織ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA的表達(dá)。免疫組化和免疫印跡(Western blot)分別檢測(cè)ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表達(dá)水平。并同時(shí)利用免疫共沉淀法(CO-IP)探討ATF3、ATF4、KLF2與N

3、rf2蛋白之間的相互作用。(2)臨床試驗(yàn)部分:肺癌患者手術(shù)切除肺組織標(biāo)本40例,所有患者術(shù)前均詢(xún)問(wèn)病史,進(jìn)行體檢、X線胸片或肺部 CT和肺功能檢測(cè),其中COPD組和對(duì)照組各20例。原位雜交分析各組患者肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA水平,免疫組化檢測(cè)肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果
　　(1)大鼠肺

4、功能指標(biāo)(FEV0.3、FEV0.3/FVC％、PEF)在COPD組較對(duì)照組明顯降低(P均<0.01)。COPD組大鼠肺部病理改變符合COPD的形態(tài)學(xué)改變。
　　(2) ROS含量在COPD組較對(duì)照組顯著增高(P<0.01),γ-GCS-HS活性在COPD組較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)。
　　(3)原位雜交結(jié)果顯示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS mRNA在兩組大鼠肺組織中的表達(dá)部位基本一致,主

5、要見(jiàn)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞,且ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA在COPD組顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)但兩組Nrf2 mRNA比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。RT-PCR結(jié)果與原位雜交結(jié)果一致。
　　(4)免疫組化結(jié)果顯示:ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞,小血管平滑肌中亦有少許表達(dá)。ATF3、ATF4、K

6、LF2、Nrf2在COPD組以胞核表達(dá)為主,γ-GCS-HS在胞漿胞核均有免疫著色,其差異具顯著性(P均<0.05)。Western blotting結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致(P均<0.05)。
　　(5)免疫共沉淀顯示:在 Nrf2抗體捕獲的免疫沉淀中,ATF3、ATF4、KLF2抗體均可雜交出明顯的蛋白條帶,且COPD組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　(6) SPSS16.0軟件行直線相關(guān)分析:大鼠肺組織中ATF3、ATF

7、4、KLF2、Nrf2蛋白表達(dá)與γ-GCS-HS mRNA、蛋白及酶活性均呈正相關(guān)(均P<0.05);ATF3、ATF4、KLF2蛋白表達(dá)與Nrf2蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(均P<0.05);ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2蛋白表達(dá)與 ROS呈正相關(guān)(均P<0.05)。
　　2.臨床試驗(yàn)結(jié)果
　　(1) COPD患者肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、γ-GCS-HS mRNA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),較對(duì)照組顯著升高(均P<0.01

8、),而Nrf2 mRNA在兩組肺組織中均呈陽(yáng)性表達(dá),兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　(2) ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白在COPD患者肺組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),較對(duì)照組明顯增高(均P<0.01)。
　　(3) SPSS16.0軟件行直線相關(guān)分析:ATF3、ATF4、KLF2蛋白表達(dá)與Nrf2蛋白、γ-GCS-HS mRNA及蛋白表達(dá)均呈明顯正相關(guān)(均P<0.01),而與Nrf2 m

9、RNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。另肺組織中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCS-HS蛋白表達(dá)與FEV1(%)、FEV1/FVC(%)均呈正相關(guān)(均P<0.01)。
　　【結(jié)論】
　　1.在COPD氧化應(yīng)激狀況下,體內(nèi)重要抗氧化酶γ-GCS可代償性上調(diào),而Nrf2是γ-GCS表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,可增加GSH合成,降低ROS,對(duì)抗氧化損傷。
　　2.在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過(guò)程中,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)