TROP2在慢性阻塞性肺疾病氣道重塑中作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD;簡稱慢阻肺)，是一種臨床病理表現(xiàn)復(fù)雜的異質(zhì)性疾病。其病理生理特點是進行性發(fā)展的氣流受限，形成氣流受限的病理基礎(chǔ)在于氣道重塑和肺泡破壞，主要與香煙及生物燃料造成直接破壞以及炎癥損傷有關(guān)。
　　氣道上皮是有害顆粒的直接承受者，在氣道損傷中首當(dāng)其沖。氣道上皮細胞發(fā)生損傷后迅速啟動修復(fù)機制?；准毎菤獾郎掀さ母杉?/p>

2、胞群，在氣道損傷后通過增殖、遷移并分化成新的上皮，完成修復(fù)過程。基底細胞功能紊亂在慢阻肺氣道上皮損傷后的異常修復(fù)中發(fā)揮舉足輕重的作用:如過度增殖會導(dǎo)致細胞增生，氣道壁增厚;異常分化可以導(dǎo)致鱗狀上皮化生、杯狀細胞增多進而黏液高分泌，這些改變均與慢阻肺早期氣道重塑病理表現(xiàn)密切相關(guān)。深入了解基底細胞的功能和調(diào)控機制，對于慢阻肺的早期干預(yù)具有重要的臨床意義。
　　TROP2(Trophoblast antigen2，滋養(yǎng)層細胞表面抗原2)

3、，是一種TACSTD(tumor-associated calcium signal transducer，腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)基因家族跨膜糖蛋白，其高表達可以為上皮源性腫瘤細胞的生長和侵襲提供重要信號。值得關(guān)注的是，新近研究證實TROP2具備調(diào)控干細胞生長的能力。Andrew S等研究發(fā)現(xiàn)，前列腺基底細胞中僅高表達TROP2的細胞具備成球能力和分化潛能。在小鼠肝臟中，TROP2可作為卵圓細胞（被認(rèn)為肝臟干細胞）的標(biāo)記，在肝損傷后可

4、檢測到其特異性表達于未分化的卵圓細胞中，且表達量和誘導(dǎo)損傷時間成正比。
　　以上證據(jù)提示，TROP2在干細胞的更新和生長中發(fā)揮重要作用，然而TROP2在慢阻肺氣道基底干細胞表達及其意義未見相關(guān)報道，針對此問題，本課題對慢阻肺患者氣道上皮TROP2表達水平及其對基底細胞的調(diào)控作用進行研究。
　　研究目的:
　　檢測慢阻肺患者氣道基底細胞TROP2表達情況，分析其對基底細胞增生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、炎癥因子分泌等生物學(xué)

5、行為的調(diào)控作用，探討TROP2在慢阻肺氣道上皮重塑中可能發(fā)揮的作用。
　　研究方法:
　　1.慢阻肺患者氣道基底細胞TROP2表達
　　1.1.病例選擇選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2012年至2014年因肺部病變行肺葉切除術(shù)患者，收集遠離病變5cm以上肺組織標(biāo)本。病例分組包括:慢阻肺吸煙組（24例），吸煙對照組(24例)，和不吸煙對照組（24例）。
　　1.2.免疫組化染色檢測氣道上皮TROP2表達;基底細胞標(biāo)志物Cyt

6、okeratin5和TROP2免疫熒光雙重染色對TROP2在氣道上皮中的表達進行定位分析。
　　1.3.對TROP2表達水平和FEV1％進行相關(guān)性分析。
　　1.4.免疫組化染色檢測三組樣本的氣道上皮增生指數(shù)Ki67(％)。
　　1.5.對TROP2表達水平和氣道上皮增生指數(shù)Ki67(％)進行相關(guān)性分析。
　　2.TROP2對氣道基底細胞增殖的影響及機制研究
　　2.1.氣道基底細胞的分離、培養(yǎng):選取就診于

7、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院行常規(guī)纖維支氣管鏡的患者（包括肺功能正常者和輕、中度慢阻肺患者）進行上皮細胞刷檢。應(yīng)用BEGM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)基底細胞。使用基底細胞標(biāo)志物Cytokeratin5、p63行免疫熒光雙標(biāo)記，鑒定氣道基底細胞。
　　2.2過表達及沉默TROP2基因:構(gòu)建pcDNA3.1-TROP2質(zhì)粒及siRNA-TROP2序列，采用脂質(zhì)體Lipo2000進行細胞轉(zhuǎn)染。pcDNA3.1-TROP2轉(zhuǎn)染至正?；准毎筎ROP2高表達，s

8、iRNA-TROP2轉(zhuǎn)染至慢阻肺基底細胞使TROP2低表達。轉(zhuǎn)染48小時后應(yīng)用Westernblot和RT-PCR方法驗證轉(zhuǎn)染效果。
　　2.3.實驗分為處理組（TROP2基因轉(zhuǎn)染或沉默的基底細胞）和對照組（包括陰性對照和空白對照），通過CCK-8檢測、細胞周期檢測、劃痕實驗明確TROP2上調(diào)或沉默對氣道基底細胞增殖和損傷修復(fù)能力的影響。
　　2.4.TROP2促氣道基底細胞增殖機制研究:上調(diào)TROP2表達，Western

9、blot方法檢測磷酸化的ERK1/2水平，以及ERK下游信號分子細胞周期蛋白Cyclin D1的表達;為明確pERK1/2在TROP2促基底細胞增殖中的作用，使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理細胞，檢測ERK蛋白磷酸化水平及Cyclin D1表達水平;CCK-8檢測基底細胞增殖情況。
　　3.TROP2對氣道基底細胞EMT樣改變和炎癥因子分泌的影響
　　3.1.慢阻肺氣道基底細胞EMT標(biāo)志物檢測:免疫熒光雙染檢測慢阻肺及對照組

10、的氣道上皮中Cytokeratin5及Vimentin（間質(zhì)細胞標(biāo)志物）表達。
　　3.2.TROP2對氣道基底細胞EMT標(biāo)志物表達的影響:TROP2基因轉(zhuǎn)染正常氣道基底細胞，使TROP2過表達，Western blot檢測EMT標(biāo)志物E-cadherin及Vimentin變化;收集來自慢阻肺患者的氣道基底細胞進行體外培養(yǎng)，沉默基底細胞TROP2后，檢測EMT標(biāo)志物變化。
　　3.3.TROP2對基底細胞炎癥因子分泌的影響:

11、將pcDNA3.1-TROP2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染氣道基底細胞，應(yīng)用ELISA方法檢測TROP2過表達和對照組細胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達水平。
　　3.4.炎癥因子在TROP2促氣道基底細胞EMT改變中作用的研究:IL-6、IL-8、IL-1β中和抗體預(yù)處理TROP2過表達基底細胞，Western Blot檢測EMT標(biāo)志物變化。
　　3.5.ERK1/2在TROP2促基底細胞EMT改變和炎癥因子分泌中

12、作用的研究:使用ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理TROP2過表達基底細胞，ELISA方法檢測上清液中IL-6、IL-8、IL-1β表達水平，Western Blot檢測EMT標(biāo)志物改變。
　　結(jié)果:
　　1.肺組織標(biāo)本研究
　　1.1.一般資料比較:三組病人年齡上無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.74)。COPD吸煙組及吸煙對照組的吸煙指數(shù)無顯著差異(P=0.10)。COPD吸煙組FEV1％與FEV1/FVC均顯著低于吸煙對照組

13、和非吸煙對照組(P＜0.05，P＜0.05)。吸煙對照組與非吸煙對照組的FEV1％、FEV1/FVC無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.41，P--0.30)。
　　1.2慢阻肺氣道基底細胞TROP2表達上調(diào):COPD吸煙組氣道上皮TROP2呈強陽性表達(P＜0.05，P＜0.05)。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，TROP2和Cytokeratin5在氣道基底部位重合染色，表明高表達的TROP2蛋白來源于慢阻肺患者氣道基底細胞。
　　1.3.TR

14、OP2表達水平與氣流受限密切相關(guān):氣道基底細胞TROP2表達量與FEV1％呈負(fù)相關(guān)(r=-0.53，P＜0.01)。
　　1.4.慢阻肺氣道上皮ki67表達增多:免疫組化染色結(jié)果顯示，慢阻肺患者氣道上皮Ki67陽性染色細胞數(shù)明顯增多。Ki67陽性細胞比率(％)在正常對照組、吸煙對照組和COPD吸煙組的表達逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　1.5.TROP2表達量和Ki67顯著相關(guān):在慢阻肺肺組織樣本中，TRO

15、P2和Ki67陽性染色細胞比率(％)呈顯著正相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.878，P＜0.01)。
　　2.TROP2對基底細胞增殖的影響及機制研究
　　2.1.氣道基底細胞鑒定:細胞免疫熒光染色顯示，細胞同時表達基底細胞標(biāo)志物Cytokeratin5和p63(＞95％)，鑒定為氣道基底細胞。
　　2.2.成功構(gòu)建TROP2過表達及低表達基底細胞模型:TROP2基因轉(zhuǎn)染基底細胞48小時后，轉(zhuǎn)染組TROP2 mRNA表達

16、量較對照組提高約4倍(P＜0.05);蛋白表達量較對照組增高約2.5倍(P＜0.05)。siRNA轉(zhuǎn)染慢阻肺基底細胞48小時后，TROP2 mRNA表達量較對照組降低約75％(P＜0.05)，蛋白表達量較對照組降低約60％(P＜0.05)。
　　2.3.TROP2過表達促進細胞增殖及損傷修復(fù):CCK-8結(jié)果表明，TROP2過表達的細胞增殖能力較對照組細胞明顯增加(P＜0.05)。流式細胞術(shù)檢測TROP2過表達后細胞周期分布的改變，

17、G1期細胞較對照組減少，進入S期細胞顯著增多(P＜0.05)。在劃痕損傷后24和48小時，TROP2過表達基底細胞相對損傷面積明顯低于對照組細胞(P＜0.05)。
　　2.4.TROP2基因沉默減弱基底細胞增殖及損傷修復(fù):CCK8生長曲線結(jié)果顯示，下調(diào)慢阻肺基底細胞TROP2表達后，增殖能力明顯降低(P＜0.05)，細胞周期示S期比例降低(P＜0.05);劃痕24小時和48小時后，TROP2沉默組細胞修復(fù)能力顯著減弱(P＜0.05

18、)。
　　2.5.ERK/MAPK信號通路在TROP2促基底細胞增殖中發(fā)揮作用:TROP2基因轉(zhuǎn)染48小時后，ERK蛋白的磷酸化增加，Cyclin D1表達增多(P＜0.05)。U0126預(yù)處理細胞后，TROP2誘導(dǎo)的ERK蛋白磷酸化顯著降低，Cyclin D1表達減少(P＜0.05); CCK-8試驗顯示U0126預(yù)處理的pcDNA3.1-TROP2細胞增殖能力較未處理組降低(P＜0.05)，表明pERK1/2可能參與了TROP

19、2對基底細胞增殖的調(diào)控作用。
　　3.TROP2促進氣道基底細胞EMT樣改變和炎癥因子分泌
　　3.1.慢阻肺氣道基底細胞存在EMT現(xiàn)象:肺組織免疫熒光雙染結(jié)果顯示，部分Cytokeratin5+基底細胞有Vimentin陽性著色，慢阻肺基底細胞Vimentin染色陽性細胞比率較對照顯著增多(P＜0.05)。
　　3.2.TROP2促進氣道基底細胞EMT標(biāo)志物表達:TROP2過表達組Vimentin表達較陰性對照和空白

20、對照細胞明顯增多，E-cadherin表達降低(P＜0.05)。沉默慢阻肺基底細胞TROP2后，基底細胞E-cadherin表達增加，間質(zhì)細胞標(biāo)志物Vimentin表達減低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.3.TROP2過表達促進基底細胞分泌炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β: TROP2轉(zhuǎn)染48小時，細胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1β較陰性對照顯著增加（P均＜0.05）。在三組細胞的TNF-α水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)

21、差異(P＞0.05)。
　　3.4.抑制炎癥因子對TROP2促氣道基底細胞EMT樣改變無明顯影響:使用中和抗體阻斷IL-6、IL-8、IL-1β后，TROP2過表達基底細胞的E-cadherin和Vimentin表達較對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.5.抑制ERK1/2對TROP2促基底細胞EMT樣改變和炎癥因子分泌無顯著影響:使用U0126預(yù)處理細胞，TROP2過表達后氣道基底細胞EMT改變和炎癥因子分泌均未受

22、明顯影響(P＞0.05; P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.TROP2在慢阻肺氣道基底細胞中顯著高表達，TROP2表達水平與氣道上皮增生指數(shù)及肺功能氣流阻塞程度顯著正相關(guān)。
　　2.體外細胞實驗表明，TROP2過表達能夠促進氣道基底細胞增殖，這種作用可能通過ERK/MAPK信號途徑實現(xiàn)。
　　3.TROP2能夠促進氣道基底細胞發(fā)生EMT樣改變，并促進炎癥因子IL-6、IL-8和IL-1β釋放，可能在慢阻肺氣道