Nrf2及其信號激酶調(diào)節(jié)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病中的作用.pdf

1、目的:通過觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠和患者肺內(nèi)Gβ蛋白(Gβ)、非典型蛋白激酶C(aPKC)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、蛋白激酶B(PKB)、紅系衍生的核因子2相關(guān)因子2(Nrf2)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表達(dá),探索Nrf2和γ-GCS感受氧化應(yīng)激的信號途徑,及其在COPD發(fā)病中可能的參與機(jī)制,為COPD的發(fā)病機(jī)理提供新的理論依據(jù),為其治療提供新的策略和方法。
　　方法:分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)。1.動(dòng)

2、物實(shí)驗(yàn):健康雄性Wistar大鼠16只,隨機(jī)分COPD模型組和對照組,每組8只。采用每日熏香煙和兩次氣管內(nèi)滴入脂多糖(LPS)法制作COPD大鼠模型。測定大鼠肺功能并觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變;檢測大鼠肺組織中γ-GCS活性,原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肺組織中γ-GCS mRNA的表達(dá),免疫組化和免疫印跡(western blot)分析肺組織中γ-GCS與Nrf2蛋白、磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(P-ERK)、磷

3、酸化非典型蛋白激酶C(P-aPKCι/ζ)、磷酸化蛋白激酶B(P-PKB)、Gβ蛋白(Gβ)蛋白水平。2.臨床實(shí)驗(yàn):手術(shù)切除肺癌患者肺組織標(biāo)本18例,所有患者術(shù)前均行肺功能檢測,COPD診斷符合中華醫(yī)學(xué)會2002年制定的標(biāo)準(zhǔn),其中COPD組和對照組各9例,檢測肺組織中γ-GCS活性,原位雜交檢測肺組織中γ-GCS mRNA的表達(dá),免疫組化分析肺組織中Gβ、Nrf2、γ-GCS與磷酸化的ERK、aPKCι/ζ、PKB蛋白水平。
　　

4、結(jié)果:
　　1.COPD組大鼠PEF和FEV0.3較對照組降低(P<0.05)。病理學(xué)上符合慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫改變。
　　2.COPD大鼠模型組中γ-GCS活性明顯升高,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　3.COPD組大鼠支氣管、肺泡上皮細(xì)胞和小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿中γ-GCS mRNA呈強(qiáng)陽性表達(dá);對照組在相應(yīng)部位呈弱表達(dá)或不表達(dá),兩組圖像吸光度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。RT-PC

5、R顯示,對照組肺中有一定量γ-GCS mRNA表達(dá),但相對于COPD組仍較低(P<0.01)。
　　4.Nrf2、γ-GCS和P-ERK、P-aPKCι/ζ、P-PKB蛋白陽性信號主要分布在肺泡、支氣管壁細(xì)胞及小血管平滑肌細(xì)胞胞漿中,Nrf2、P-ERK、P-aPKCι/ζ、P-PKB在胞核也有表達(dá);圖象定量分析示COPD組Nrf2、γ-GCS與P-ERK、P-aPKCι/ζ、P-PKB表達(dá)高于對照組(P<0.01),而Gβ蛋白表

6、達(dá)較弱,與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.Western blot顯示COPD組大鼠Nrf2、γ-GCS和P-ERK、P-aPKCι/ζ、P-PKB蛋白表達(dá)皆有明顯上調(diào),高于對照組(P<0.01);
　　6.COPD組患者中γ-GCS活性明顯升高,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　7.原位雜交結(jié)果示:COPD組患者支氣管、肺泡上皮細(xì)胞中γ-GCS mRNA呈強(qiáng)陽性表達(dá),與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P<0.01);免疫組化示Nrf2、γ-GCS和P-ERK、P-aPKCι/ζ蛋白陽性信號在COPD患者組肺組織中呈強(qiáng)表達(dá),與對照組比較可見差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而P-PKB、Gβ蛋白在COPD患者肺組織中表達(dá)較弱,與對照組圖像吸光度分析比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8.SPSS10.0軟件進(jìn)行直線相關(guān)分析,在大鼠和臨床實(shí)驗(yàn)中均可見P-ERK、P-aPKC蛋白表達(dá)與Nrf2蛋白表達(dá)呈正相關(guān),Nrf2蛋白表達(dá)與γ-GC