PI3K-Akt、aPKC-,ι-ζ--Nrf2調(diào)控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表達(dá).pdf

1、目的：研究濃度為10％的香煙煙霧提取物(CSE)在不同時(shí)期對(duì)大鼠氣管上皮細(xì)胞磷脂酰肌醇—3—激酶(phosphatidylinositol—3—kinase，PI3K)/Akt、不典型蛋白激酶Cι/ζ(aPKCι/ζ)、Nrf2(Nuclearfactor—E2relatedfactor)和γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ—GCS)的表達(dá)調(diào)控，闡明香煙煙霧對(duì)PI3K/Akt、aPKCι/ζ、Nrf2和核轉(zhuǎn)位的影響及對(duì)γ—GCS表達(dá)調(diào)控在氧化

2、/抗氧化機(jī)制中的作用。探討PI3K特異性抑制劑LY294002、aPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220在香煙煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激情況下對(duì)大鼠氣管上皮細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位和γ—GCS表達(dá)調(diào)控，闡明PI3K/Akt信號(hào)通路與aPKCι/ζ信號(hào)通路關(guān)系及PI3K/Akt、aPKCι/ζ對(duì)Nrf2的激活和核轉(zhuǎn)位及對(duì)γ—GCS的表達(dá)水平和活性的影響在氧化/抗氧化機(jī)制中的作用。 方法：實(shí)驗(yàn)共分兩部分。將體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞用含20％F

3、CS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后隨機(jī)分為兩部分，一部分根據(jù)暴露10％CSE不同時(shí)期分為5組：Oh對(duì)照組，暴露1h，3h，6h，12h組(CSEOh，CSE1h，CSE3h，CSE6h，CSE12h)。另一部分也分為5組：Oh陰性對(duì)照組、CSE3h陽(yáng)性對(duì)照組、LY294002組、R0—31—8220組和LY294002+R0—31—8220組，抑制劑組為在暴露CSE前0.5h加入10mMPI3K特異性抑制劑LY294002和/或3

4、uMaPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220培養(yǎng)3h。觀察香煙煙霧在不同時(shí)期、PI3K特異性抑制劑、aPKCι/ζ特異性抑制劑對(duì)大鼠氣管上皮細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位及γ—GCS的影響；用免疫熒光及Westernblot方法觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位和胞漿、胞核蛋白質(zhì)表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot方法檢測(cè)γ—GCS的表達(dá)水平；逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)方法分析γ—GCSmRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞技術(shù)、Westernblot方

5、法分析p—Akt蛋白質(zhì)表達(dá)水平和陽(yáng)性細(xì)胞比率；Westernblot方法檢測(cè)aPKCι/ζ蛋白質(zhì)表達(dá)水平；參照Tietze方法測(cè)體外培養(yǎng)氣管上皮細(xì)胞還原型谷胱甘肽(GSH)的含量；參照雙酶法測(cè)體外培養(yǎng)氣管上皮細(xì)胞γ-GCS的活性。 結(jié)果： 第一部分： 1．體外培養(yǎng)的氣管上皮細(xì)胞經(jīng)10％CSE處理后，GSH含量在1h降低，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)；3h較對(duì)照組增高(P＜0.05)，6h達(dá)高峰；12h恢復(fù)

6、正常水平(P＞0.05)。 2．Nrf2在對(duì)照組、CSE12h組主要表達(dá)在胞漿，然而，在CSE1h、3h、6h組主要表達(dá)在胞核；Nrf2胞核蛋白質(zhì)在對(duì)照組有一定表達(dá)，暴露CSE后1h、3h、6h胞核蛋白質(zhì)高表達(dá)，與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，但各組間表達(dá)無(wú)明顯差異，12h低表達(dá)，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；Nrf2胞漿蛋白質(zhì)在對(duì)照組和CSE12h組高表達(dá)，而在CSE1h、CSE3h、CSE6h組表達(dá)降低

7、，各組間表達(dá)無(wú)明顯差異，但與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。 3．p-Akt蛋白質(zhì)在對(duì)照組弱表達(dá)，當(dāng)暴露CSE后1h，其蛋白質(zhì)表達(dá)增高，3h達(dá)高峰，兩組與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，6h降低，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，12h保持低水平。表達(dá)p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞比率逐漸增強(qiáng)，3h達(dá)到最高，然后逐漸減少，6h恢復(fù)正常，12h維持低比率。 4．p-aPKCι/ζ蛋白質(zhì)在CSE1h組開始表達(dá)增高，在

8、CSE3h組最高，約為正常的3倍，在CSE6h組表達(dá)減弱，三組與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，CSE12h組表達(dá)低水平，與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 5．RT-PCR結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞暴露于CSE，γ-GCSmRNA、蛋白質(zhì)和γ-GCS活性1h開始增強(qiáng)，3h明顯增強(qiáng)，6h達(dá)最高水平，12h表達(dá)減弱，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。γ-GCS蛋白質(zhì)在對(duì)照組氣管上皮細(xì)胞胞漿中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，CSE1h組、

9、CSE3h組呈陽(yáng)性表達(dá)，CSE6h組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而CSE12h組呈弱陽(yáng)性表達(dá)。 6．相關(guān)性分析示經(jīng)10％CSE處理后的氣管上皮細(xì)胞中，Nrf2與γ-GCS-h、γ-GCS活性、p-Akt和p-aPKCι/ζ呈正相關(guān)，γ-GCS與GSH、γ-GCS活性、aPKCι/ζ及Nrf2呈正相關(guān)，p-Akt與Pr-aPKCι/ζ及Nrf2成正相關(guān)，p-aPKCι/ζ與γ-GCS、γ-GCS活性、p-Akt及Nrf2成正相關(guān)(P＜0.05)

10、。 第二部分： 1．當(dāng)預(yù)先予以PI3K特異性抑制劑LY294002和/或aPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220處理后，三組抑制劑組GSH含量較CS3h組減少(P＜0.05)，但比對(duì)照組高，有顯著性差異(P＜0.05)，三組抑制劑組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 2．Nrf2在對(duì)照組主要表達(dá)部位在胞漿，在LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組中主要表達(dá)部位在胞核，提示PI3K特異性抑制

11、劑LY294002和aPKCι/ζ特異性抑制劑R0—31—8220不影響Nrf2核轉(zhuǎn)位。Nrf2胞核蛋白質(zhì)在對(duì)照組弱表達(dá)，LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組表達(dá)增高，與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，而與CSE3h組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，三組抑制劑組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3．γ—GCSmRNA、蛋白質(zhì)在對(duì)照組呈低表達(dá)，LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組

12、較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，較CSE3h低(P＜0.05)，三組抑制劑組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。γ—GCS蛋白質(zhì)在對(duì)照組氣管上皮細(xì)胞胞漿中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在LY294002組、R0—31—8220組和兩種抑制劑組呈陽(yáng)性表達(dá)，CSE3h組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。 4．在LY294002組，p—Akt蛋白質(zhì)和P—aPKCι/ζ蛋白質(zhì)都低表達(dá)，在R0—31—8220組，p—Akt蛋白質(zhì)高表達(dá)，而P—aPKCι/ζ低表達(dá)。在LY29

13、4002組，表達(dá)p—Akt陽(yáng)性細(xì)胞比率降低，在R0—31—8220組，表達(dá)p—Akt陽(yáng)性細(xì)胞比率增高。 結(jié)論： 1．香煙煙霧調(diào)節(jié)γ—GCS表達(dá)和GSH合成。 2．體外培養(yǎng)的氣管上皮細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧提取物處理后的一定時(shí)期Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，說(shuō)明在氧化應(yīng)激情況下，Nrf2可能是調(diào)控γ—6CS表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。 3．PI3k特異性抑制劑和aPKCι/ζ特異性抑制劑影響γ—GCS蛋白質(zhì)、γ—GCSmRNA表達(dá)、γ