人支氣管上皮細(xì)胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景: 肺及支氣管組織易受到來源于體內(nèi)外各種氧化因素的作用而形成損害，發(fā)展成炎癥性疾病或腫瘤。谷胱甘肽(GSH)是肺組織內(nèi)抗氧化機(jī)制中的最重要因素之一。多種刺激可在不同水平調(diào)節(jié)肺組織細(xì)胞內(nèi)外的GSH濃度，其中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GSH合成的限速酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外GSH濃度，促進(jìn)肺及支氣管組織損傷修復(fù)或保護(hù)肺組織免受氧化損害。對γ-GCS特別是催化亞單位(GCLC)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)

2、控進(jìn)行研究有助于在分子生物學(xué)水平了解GSH變化的機(jī)制。 目的: 對人γ-GCS催化亞單位(GCLC)基因調(diào)控區(qū)進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)對GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要作用的基因調(diào)控元件及其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，明確GCLC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，從而部分闡明GCLC及GSH在細(xì)胞內(nèi)外的變化機(jī)制，為在分子生物學(xué)水平闡明肺疾病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)，并最終為治療肺疾病找到合適的干預(yù)措施。 方法: 一．克隆人GCLC基因調(diào)控區(qū)的

3、基因片段：(一)以GenBank公布的人GCLC基因的核苷酸序列(GI：4902626)為模板設(shè)計(jì)并合成PCR引物。(二)以高保真DNA聚合酶應(yīng)用PCR方法從人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE中提取的基因組DNA中克隆基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位置-3490—+523 bp、+3490—+451 bp、-3490—+131bp、-2744—+81bp的目的基因片段，并進(jìn)行T-A克隆，送測序公司測序。(三)將成功克隆的目的基因片段亞克隆至含增強(qiáng)子而無啟動(dòng)

4、子的能表達(dá)蟲熒光素酶報(bào)告基因的PGL-3載體中，構(gòu)建野生型表達(dá)質(zhì)粒。 二．基因突變：(一)構(gòu)建能表達(dá)蟲熒光素酶基因的系列嵌套缺失突變體質(zhì)粒：1．對能表達(dá)蟲熒光素酶基因的野生型質(zhì)粒PL28應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Mlu I及Sac I進(jìn)行雙酶切，使其線性化。按意義鏈的DNA順序，經(jīng)內(nèi)切酶修飾的線性DNA片段的5`端、3`端均為含四個(gè)堿端突出的粘性末端，而反意義鏈的3`端為四個(gè)堿基的凹端。2．核酸外切酶Ⅲ及S1核酸酶體系作用已線性化的質(zhì)粒P

5、L28基因片段。3．通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定及測序篩選鑒定有效的序列缺失體表達(dá)質(zhì)粒。(二)應(yīng)用重疊延伸PCR方法對GCLC基因調(diào)控區(qū)的ARE調(diào)控元件、E-box調(diào)控元件及NF-κB調(diào)控元件進(jìn)行缺失突變，將突變的基因片段進(jìn)行T-A克隆，送測序公司測序鑒定。成功突變ARE調(diào)控元件、E-box調(diào)控元件及NF-κB調(diào)控元件的基因片段亞克隆至已構(gòu)建成功的能表達(dá)蟲熒光素酶報(bào)告基因的野生型質(zhì)粒中，替代含有上述調(diào)控元件的基因片段，構(gòu)建表達(dá)蟲熒光素酶

6、報(bào)告基因的缺失突變型質(zhì)粒。 三．基因調(diào)控功能研究：將野生型表達(dá)質(zhì)粒、突變型表達(dá)質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pSV-β-gal共轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE，檢測基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)β-gal和蟲熒光素酶活性的量值，以質(zhì)粒表達(dá)的蟲熒光素酶相對活性值揭示基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 四．基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄因子的鑒定：采用地戈辛標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸作為陽性探針，未標(biāo)記的含AP-2、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的雙鏈寡核苷酸作為競爭性探針與核蛋白提取物

7、進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)性分析(EMSA)；以結(jié)合人AP-2、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的抗體進(jìn)行超泳動(dòng)分析(super-shift)。 結(jié)果: 一．成功克隆出人GCLC基因調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位置-3490—+523 bp、-3490—+451 bp、-3490—+131bp、-2744—+81bp區(qū)間的目的基因片段，構(gòu)建表達(dá)蟲熒光素酶基因的表達(dá)質(zhì)粒PL91、PL45、PL34、PL28。 二．成功構(gòu)建出表達(dá)蟲熒光素酶基因的

8、系列缺失突變體質(zhì)粒，其名稱及相對基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位置如下表。 三．成功構(gòu)建出缺失突變ARE調(diào)控元件、E-box調(diào)控元件及NF-B調(diào)控元件的表達(dá)蟲熒光素酶基因的突變體表達(dá)質(zhì)粒PLdel-ARE、PLdel-E-Box、PLA4及PLA5。 四．野生型質(zhì)粒PL91無基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，可作為陰性對照質(zhì)粒；野生型質(zhì)粒PL45、PL34、PL28質(zhì)粒的基因調(diào)控片段的基因調(diào)控功能無差別，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游+81bp以遠(yuǎn)的3`UTR區(qū)對

9、基因轉(zhuǎn)錄影響不明顯。 五．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-810—769bp區(qū)間存在負(fù)性調(diào)控區(qū)；在-864—838bp、-769—538bp、-421—341bp區(qū)間存在正性調(diào)控區(qū)。 六．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-810—769bp區(qū)間的-784—770區(qū)域?yàn)锳P-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件部位，其與轉(zhuǎn)錄因子AP-2相互作用后起重要的負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 七．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-810—769bp區(qū)間的-79

10、0—785區(qū)域?yàn)榫哂姓哉{(diào)控作用，定點(diǎn)缺失后GCLC基因轉(zhuǎn)錄功能明顯下降；該區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 八．轉(zhuǎn)錄因子AP-2能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-790—766DNA序列的結(jié)合。 九．突變體質(zhì)粒PLdel-ARE、PLdel-E-Box表達(dá)功能明顯上升表明：ARE、E-Box調(diào)控元件具有負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 結(jié)論: 一．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)近端存在多個(gè)正性及負(fù)性

11、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)：在基因調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-864—838bp、-769—538bp、-421—341bp區(qū)間存在正性調(diào)控區(qū)；GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-810—769bp區(qū)間存在負(fù)性調(diào)控區(qū)，其重要的負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是AP-2，作用的轉(zhuǎn)錄因子為AP-2。 二．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)-790—785為正性調(diào)控區(qū)，為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件NF-кB所在位置，其作用的轉(zhuǎn)錄因子為NF-кB。轉(zhuǎn)錄因子AP-2可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-кB與-790

12、—766 DNA序列結(jié)合。 三．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)遠(yuǎn)端存在兩個(gè)負(fù)性調(diào)控元件：1 ARE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于人類GCLC基因調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-3148—3138bp區(qū)，其DNA系列與AP-1調(diào)控元件重疊。2 E-box調(diào)控元件位于人類GCLC基因調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-3100—3087bp區(qū)。 四．本實(shí)驗(yàn)研究克隆構(gòu)建了多個(gè)以GCLC基因調(diào)控區(qū)啟動(dòng)和調(diào)控的表達(dá)蟲熒光素酶報(bào)告基因的野生型質(zhì)粒及相應(yīng)的突變型質(zhì)粒。為今后