人支氣管上皮細(xì)胞GCLC基因調(diào)控區(qū)AP-2元件的研究.pdf

1、背景:
　　氧化應(yīng)激是許多急性或慢性肺部疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一,嚴(yán)重危害了人類的健康。谷胱甘肽(glutathione,GSH)是人體內(nèi)重要的保護(hù)性抗氧化物質(zhì)。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是體內(nèi)合成GSH的限速酶,其由催化亞單位(GCLC)和調(diào)節(jié)亞單位(GCLM)組成。GCLC含有γ-GCS所有底物的結(jié)合位點(diǎn)和所有的催化亞基,故具有γ-GCS所有的催化活性。因此,GCLC基因表達(dá)水平將很大程度影響體內(nèi)GSH的含量。本課題

2、組前期的研究通過轉(zhuǎn)錄因子分析軟件分析發(fā)現(xiàn),人GCLC基因上游-790~-766區(qū)域內(nèi)有AP-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)AP-2(-784~-770)結(jié)合元件及NF-κB(-790~-785)結(jié)合元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行進(jìn)一步的研究,有助于在分子生物學(xué)水平了解GSH的變化機(jī)制。
　　目的:
　　分析人GCLC基因上游-790~-766區(qū)域內(nèi)AP-2(-784~-770)元件及NF-κB(-790~-785)元

3、件的作用,探索其可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。從而部分闡明GSH水平變化的機(jī)制,為在分子生物水平闡明肺疾病發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、設(shè)計(jì)四種含突變AP-2元件(-784~-770)的基因片段(-790~-766),并人工合成對(duì)應(yīng)的突變探針。采用電泳遷移率分析(EMSA)實(shí)驗(yàn)觀察突變探針是否能與核蛋白特異性結(jié)合,并用超級(jí)遷移率實(shí)驗(yàn)(Supershift assay)檢測(cè)突變探針是否能與轉(zhuǎn)錄因子AP-2和NF-κB

4、的抗體結(jié)合。
　　2、運(yùn)用重疊PCR技術(shù)對(duì)AP-2元件(-784~-770)進(jìn)行定點(diǎn)突變。并構(gòu)建能表達(dá)蟲熒光素酶報(bào)告基因的突變型質(zhì)粒。
　　3、將野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒分別與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蟲熒光素酶活性值,以判斷突變AP-2元件對(duì)人GCLC基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過EMSA及Supershift試驗(yàn)篩選出其中一種含突變AP-2元件(-784~-770)的

5、基因片段(-790~-766)能與16HBE細(xì)胞核蛋白結(jié)合,但不能與轉(zhuǎn)錄因子AP-2抗體結(jié)合。
　　2、經(jīng)測(cè)序鑒定,突變AP-2載體符合預(yù)期設(shè)計(jì),成功構(gòu)建。
　　3、將成功構(gòu)建的突變AP-2質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞后檢測(cè)蟲熒光素酶活性值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變AP-2(-784~-770)質(zhì)粒較野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性明顯下降(P<0.01),說明人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域AP-2元件(-784~-770)具有