AHR-ARNT元件抑制GCLC基因在大鼠支氣管上皮細胞的表達.pdf

1、谷胱甘肽（GSH）是體內重要的抗氧化、抗炎物質，對保護組織器官免受氧化損傷具有重要作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成GSH的限速酶，其催化亞單位GCLC具有全酶的催化活性。對于該酶基因表達調節(jié)的了解能夠有助于在分子水平闡明GSH變化的機制。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，GCLC基因上游調控序列存在一個轉錄抑制區(qū)域，其中兩個E-box元件（-804～-799，-729～-724）在大鼠多種組織來源的細胞中起負性調控作用，并且具有組織

2、特異性。文獻報道和我們的實驗結果均提示E-box元件具有雙向調控的性質，這一特點與旁側元件的組成以及結合的轉錄因子有關。為此分析了大鼠GCLC基因上游調控序列中與E-box元件相鄰的元件，其中AHR/ARNT元件引起我們的關注。該基因上游存在兩個核心序列同為CACGGG的AHR/ARNT元件，其中一個（-1090～-1085）位于E-box元件附近。其結合的轉錄因子芳香烴受體核轉位蛋白（ARNT）是許多bHLH-PAS蛋白共同的專性二聚

3、化配偶體，其中包括芳香烴受體（AHR）、低氧誘導因子（HIF）1α和2α、SIM蛋白等，參與機體內許多重要的生物學過程。由于有報道指出轉錄因子ARNT能夠與E-box元件的結合蛋白USF1/2形成異源二聚體，使得E-box元件與ARNT之間相互作用的假設在理論上具有可信性，并且由于其結合的轉錄因子與低氧、毒物代謝等生命活動相關，故如果該關系存在，就可能解釋眾多關于細胞應激以及氧化-抗氧化平衡等問題。為此本研究首先對這兩個AHR/ARNT

4、元件在大鼠的GCLC基因轉錄中是否具有調控作用進行了系統(tǒng)分析。 目的:探討位于轉錄起始位點上游-1090～-1085與-215～-210bp處的兩個AHR/ARNT元件對RTE細胞內的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）催化亞單位（GCLC）是否具有轉錄抑制作用，從而了解γ-GCS基因轉錄調節(jié)特征。 方法: 1、報道載體以及真核表達載體的構建：（1）缺失AHR/ARNT元件報道載體：單缺失AHR/ARNT元件報

5、道載體的構建是以GCLC-luc（-1758～+2）為模板，按照引物導入核心序列缺失的方法，通過兩次PCR擴增出缺失-1090～-1085或-215～-210的AHR/ARNT元件的片段。兩種PCR產物膠回收后連入pGEM-T easy載體，以SacⅠ/XhoⅠ雙酶切插入pGL3-enhancer載體鑒定并測序。雙元件缺失載體GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc的構建是以GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-Luc為模板

6、進行兩輪PCR擴增，其余步驟與上述相同。（2）AHR/ARNT元件核心與相鄰序列報道載體：合成含有核心序列并包括相鄰序列的AHR/ARNT（-1090）和AHR/ARNT（-215）正義和其反向互補鏈，預留SacⅠ/XhoⅠ酶切位點，采用逐漸退火的方法使兩條單鏈互補配對，然后利用這兩個位點按常規(guī)分子克隆技術將片段克隆入pGL3-promoter載體。（3）真核表達質粒：按Invitrogen公司的Trizol試劑提供的方法提取大鼠肝臟總

7、RNA，使用逆轉錄試劑合成大鼠肝臟cDNA，PCR擴增出AHR、AHRR、ARNT2、ARNT片段。產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收后連入pGEM-T easy載體，HindⅢ/NotⅠ雙酶切鑒定并測序。測序正確目的基因片段按照常規(guī)克隆技術連入pRc/CMV2載體并測序證實。 2、調控序列的細胞內促轉錄活性的測定：將GCLC-Luc、單缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc、雙缺失AHR/ARNT元件的GCLC-L

8、uc、PGL3-Promoter以及含有AHR/ARNT元件核心與旁側序列的報告基因載體轉染大鼠RTE細胞，檢測轉染后細胞的螢光素酶活性值，來判斷AHR/ARNT元件對GCLC基因轉錄活性的影響。 3、與AHR/ARNT元件可能結合的轉錄因子過量表達實驗：將GCLC-Luc、缺失AHR/ARNT元件和雙缺失AHR/ARNT元件的報告基因載體分別與四種真核表達質粒AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2

9、-CMV2共轉染大鼠RTE細胞，通過增強AHR/ARNT元件與可能和該元件結合的反式作用因子的作用，觀察其對GCLC基因轉錄活性的影響。 4、電泳遷移率變動分析實驗（EMSA）以及Supershift：觀察在RTE細胞中AHR/ARNT元件是否有核蛋白特異性結合，并用Supershift檢測其結合的轉錄因子是否是前期實驗所推測的轉錄因子AHR以及ARNT。 結果: 1、成功構建含GCLC上游啟動子序列分別單缺失A

10、HR/ARNT元件（-1090～-1085以及-215～-210）的報告基因載體（GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-luc、GCLC-delAHR/ARNT（-215）-luc），雙缺失AHR/ARNT元件的報告基因載體（GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc），含有AHR/ARNT元件核心與旁側序列的報告基因載體（AHR/ARNT（-1090）-Promoter以及AHR/ARNT（-215）-Promoter）以及

11、真核表達載體AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2-CMV2。 2、實驗中將GCLC-Luc及其定點缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc以及PGL3-Promoter、AHR/ARNT（-1090）-Promoter和AHR/ARNT（-215）-Promoter轉染大鼠支氣管上皮細胞（RTE），結果表明缺失AHR/ARNT元件（-1090～-1085）的GCLC基因5’-上游序列的轉錄活性明

12、顯高于野生型基因5’-上游序列，GCLC-delAHR/ARNT（-1090）-luc在細胞內螢光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.16倍；而缺失兩個AHR/ARNT元件的效果與缺失上述元件相同，GCLC-DdelAHR/ARNT-luc螢光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.21倍，兩者均差異顯著；轉染AHR/ARNT（-1090）-Promoter的螢光素酶值明顯高于轉染PGL3-Promoter的螢光素酶值，是PGL3-Prom

13、oter的2.61倍。實驗結果說明AHR/ARNT元件（-1090～-1085）在RTE細胞中具有轉錄調節(jié)活性，而在GCLC基因的基礎狀態(tài)下的轉錄表達中起抑制作用。 3、將AHR-CMV2和GCLC-Luc以及單缺失或雙缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共轉染RTE細胞的螢光素酶值與CMV2空載體和GCLC-Luc以及單缺失或雙缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共轉染RTE細胞的螢光素酶值進行比較。結果提示GCL

14、C-Iuc和CMV2空載體共轉染的螢光素酶值是GCLC-luc和AHR-CMV2共轉染的螢光素酶值的2.37倍。這說明轉錄因子AHR的過表達對GCLC基因具有負性調控作用，而其它轉錄因子AHRR、ARNT以及ARNT2的過表達對GCLC基因不具有明顯調控作用。 4、電泳遷移率變動分析（EMSA）以及Supershift結果顯示GCLC基因上游調控區(qū)域的兩個AHR/ARNT元件均有核蛋白結合，并且超級遷移率變動實驗顯示結合的蛋白主