結晶型NiS誘發(fā)人支氣管上皮細胞惡性轉化的表觀遺傳改變.pdf

1、研究背景： 鎳及其化合物是人類在職業(yè)和環(huán)境中廣泛接觸的一類金屬化學物，具有多系統(tǒng)、多器官、多細胞毒性。在多種生產過程中，如鎳采礦、精煉、電鍍、鎳—鎘電池制造、不銹鋼的制造以及含鎳固體廢物的焚燒等都可在周圍環(huán)境中產生大量含鎳煙霧，人們可以因職業(yè)暴露和非職業(yè)暴露接觸。鎳化合物可經(jīng)過多種途徑進入機體，其中吸入接觸是人類暴露于鎳的主要方式。人群職業(yè)流行病學調查和動物實驗均己證實鎳的暴露可以引起腫瘤，主要為呼吸道腫瘤。國際癌癥研究中心已于

2、1990年將鎳及其化合物列為第一類致癌物。鎳致癌的機制極其復雜，目前的研究發(fā)現(xiàn)鎳可以損傷基因組DNA、誘導基因組的表觀遺傳變異、產生ROS、活化腫瘤相關的信號傳導通路、以及影響與腫瘤發(fā)生密切相關的轉錄因子的活性，但其確切的致癌機制仍未完全明了。由于鎳化合物的低誘變性及強致癌性，提示表觀遺傳學改變可能在鎳致癌過程中起作重要作用，故目前研究熱點主要集中于其表觀遺傳致癌機制。 表觀遺傳學(epigenetics)是與遺傳學(genet

3、ics)相對應的概念。在生物體內，遺傳學信息提供了生命所必需的蛋白質的模板；而表觀遺傳學的信息提供了何時、何處和何種方式應用這些遺傳學信息的指令，在時空順序上控制基因的表達，它不涉及DNA序列改變但又可以通過細胞分裂遺傳給子代細胞。表觀遺傳學機制主要涉及DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質重塑以及MicroRNA、SiRNA等。目前，表觀遺傳學研究已成為后基因組時代的生命科學研究的核心和熱點之一。表觀遺傳學異常常導致人類多種疾病，特別

4、在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳學改變起重要作用。 為了探討這些問題，本課題將利用該轉化模型，檢測細胞惡性轉化過程中基因組總體DNA甲基化水平，篩選表觀遺傳學失活的相關DNA修復基因，分析其表觀遺傳調控機制，以期揭示鎳致癌過程中表觀遺傳作用，尋找鎳致癌早期可能的表觀遺傳生物標記物，為其應用于鎳作業(yè)人群的研究提供理論依據(jù)。 方法： 1.細胞染毒：分別以0.25μg/cm2，0.5μg/cm2，1.0μg/cm2，2

5、.0μg/cm2結晶型NiS處理人支氣管上皮細胞系(16HBE)24 h，隔天再次進行相同處理，分別處理1、2、3次。 3.應用定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)及Western Blot方法檢測結晶型NiS處理細胞和轉化細胞中相關DNA修復基因(MGMT、hMLH1、hMSH6、BRCA1)的變化； 4.建立甲基化熒光PCR(MethyLight)技術，并應用該技術和亞硫酸氫鹽測序技術定量分析結晶型NiS處理細胞和轉化細

6、胞中MGM7基因啟動子CpG島DNA甲基化改變；同時分析DAC對MGMT基因CpG島啟動子DNA甲基化的影響； 5.應用Q-PCR及Western Blot方法檢測結晶型NiS處理細胞和轉化細胞中DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)和DNA甲基化結合蛋白(MeCP2、MBD2)的變化； 6.應用RNAi技術建立DNMT1缺陷的轉化細胞株(NSTC2shDNMT1)，并應用亞硫酸氫鹽測序技術分析NSTC

7、2shDNMT1細胞中MGM7基因CpG島啟動子DNA甲基化的水平； 7.建立定量染色質免疫沉淀(Q-ChIP)技術，并檢測結晶型NiS處理細胞和轉化細胞中MGMT基因啟動子區(qū)組蛋白修飾的改變；同時分析DAC和TSA對MGMT基因啟動子區(qū)組蛋白修飾的影響； 8.應用Q-ChIP技術檢測結晶型NiS處理細胞和轉化細胞中MGMT基因啟動子區(qū)DNMT1和DNA甲基化結合蛋白的結合力水平；同時分析DAC和shDNMT1對MGMT

8、基因啟動子區(qū)DNMT1和DNA甲基化結合蛋白的結合力的影響。 結果： 1.5-mC甲基化免疫熒光試驗結果顯示，結晶型NiS處理細胞DNA甲基化免疫熒光的強度均有不同程度降低，轉化細胞DNA甲基化免疫熒光的強度明顯降；Sss1甲基轉移酶法定量分析結果顯示，與陰性對照組細胞相比，0.25μg/cm2、0.5μg/cm2、1.0μg/cm2、2.0μg/cm2的結晶型NiS處理3次的細胞基因組總體甲基化程度分別降低了4.9％、

9、8.1％、19.6％、17.7％，轉化細胞(NSTC1、NSTC2)基因組總體甲基化程度降低更為顯著，分別降低了43.6％和46.8％。結果表明結晶型NiS誘發(fā)細胞惡性轉化過程中，整體基因組DNA甲基化水平降低。 2.Q-PCR和Western Blot結果顯示，與陰性對照組細胞相比，結晶型NiS處理細和轉化細胞中hMLH1、hMSH6、BRCA1基因表達無明顯改變，而MGMT基因表達下調，并在NiS處理細胞中存在劑量依賴關系，

10、在NiS轉化細胞中已表達缺失；Q-PCR、Western Blot及免疫熒光分析證實DNA甲基化轉移酶抑制劑DAC和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可分別回復轉化細胞中MGMT基因的表達，結果提示在NiS誘發(fā)的細胞轉化過程中MGMT基因表達的下調及失活是受表觀遺傳調控。 3.成功建立了甲基化熒光PCR(MethyLight)技術，并應用該技術定量分析結晶型NiS處理細胞和轉化細胞中MGMT基因啟動子CpG島(甲基化熱點區(qū)域2)DNA

11、甲基化模式，結果發(fā)現(xiàn)不同劑量的NiS處理細胞中MGMT基因CpG島啟動子DNA甲基化水平有一定升高，甲基化參照百分比(PMR)分別為2.4％、4.5％、4.8％和6.8％；轉化細胞MGMl瑾因CpG島啟動子DNA甲基化水平顯著升高，甲基化參照百分比(PMR)分別為74.6％和53.8％，DAC和TSA分別處理轉化細胞后，DNA甲基化水平顯著降低。亞硫酸氫鹽測序技術進一步分析NiS處理細胞和轉化細胞中MGMT基因CpG島啟動子(甲基化熱點

12、區(qū)域1)DNA甲基化水平，結果顯示，NiS處理細胞(NiS2)和轉化細胞(NSTC2)MGMT基因甲基化水平分別為25.6％和68.9％，而陰性對照組細胞僅為7.5％；DAC處理轉化細胞后，DNA甲基化水平下降了77.4％。結果表明，在NiS誘發(fā)的細胞轉化過程中，MGMT基因啟動子CpG島DNA高甲基化是其表達下調或失活的重要原因。 4.Q-PCR和Western Blot方法檢測DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)

13、和DNA甲基化結合蛋白(MeCP2、MBD2)的表達，結果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組細胞相比，NiS處理細胞和轉化細胞中DNMT3a、DNMT3b、MeCP2、MBD2表達無明顯改變，而DNMT1表達上調，在NiS處理細胞中升高了1.6～2.0倍，而在轉化細胞中升高了2.6～3.4倍，提示在NiS處理細胞和轉化細胞中DNMT1可能是引起DNA高甲基化的重要調控因子。為此，應用RNAi技術成功建立DNMT1缺陷的轉化細胞株(NSTC2shDNMT

14、1)，并應用亞硫酸氫鹽測序技術分析NSTC2shDNMT1細胞中MGMT基因啟動子CpG島DNA甲基化的水平，結果發(fā)現(xiàn)MGMT基因甲基化水平降低了70.4％，提示DNMT1在維持MGM7基因啟動子CpG島DNA高甲基化過程中起重要作用。 5.成功建立了定量染色質免疫沉淀(Q-ChIP)技術，并應用該技術定量分析組蛋白修飾，結果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組細胞相比，NiS處理細胞和轉化細胞中組蛋白H4，組蛋白H3K9乙?；浇档?，組蛋白H

15、3K9雙甲基化水平升高；DAC和TSA均可逆轉NiS處理細胞和轉化細胞中組蛋白修飾的改變。結果表明，在NiS誘發(fā)的細胞轉化過程中，MGMT瑾因啟動子區(qū)高組蛋白H3K9雙甲基化、低組蛋白H4和組蛋白H3K9乙?；瞧浔磉_抑制的重要表觀遺傳學特征。 6.Q-CHIP技術檢測結晶型NiS處理細胞和轉化細胞中MGMT基因啟動子區(qū)DNMT1和DNA甲基化結合蛋白的結合力水平，發(fā)現(xiàn)DNMT1、甲基化CpG結合蛋白2(MeCP2)和甲基化DN

16、A結合域蛋白2(MBD2)在MGMT基因啟動子區(qū)結合水平升高，而甲基化DNA結合域蛋白1(MBD1)的結合水平與陰性對照組細胞中水平相似，均表現(xiàn)為結合力低下。結果表明，DNMT1、MeCP2和MBD2被共同募集至MGMT基因CpG島啟動子區(qū)，負責維持MGMT基因啟動子CpG島DNA高甲基化，參與MGMT基因表達抑制的調控。ChIP-MSP技術進一步證實了DNMT1、MeCP2與MGMT基因啟動子CpG島高甲基化高度相關。 結論：