永生化人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中不同形態(tài)集落來源細(xì)胞的研究.pdf

1、評價化學(xué)物致癌性，主要依靠哺乳動物長期誘癌實(shí)驗(yàn)。但其實(shí)驗(yàn)周期長，飼養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，受試動物的敏感性和給藥劑量常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而哺乳動物細(xì)胞的體外惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)既能反映化學(xué)物的致癌性，又能彌補(bǔ)動物誘癌實(shí)驗(yàn)的不足。因此，作為對長期誘癌實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充其結(jié)果具有重要參考價值。細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的起始點(diǎn)是致癌物導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)改變，終點(diǎn)是細(xì)胞成瘤能力的改變，轉(zhuǎn)化過程中則伴隨有細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長能力、生化表型等的變化。本實(shí)驗(yàn)就以致癌物作用人支氣管上皮細(xì)

2、胞后傳代細(xì)胞集落的形態(tài)學(xué)改變?yōu)榍腥朦c(diǎn)，尋找人源細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的早期形態(tài)學(xué)標(biāo)志，持續(xù)觀察由不同形態(tài)集落而來的兩株細(xì)胞隨傳代其生長特性、細(xì)胞構(gòu)成、細(xì)胞遺傳物質(zhì)及細(xì)胞成瘤能力的變化，進(jìn)而探討肺腫瘤組織發(fā)生、人源細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)標(biāo)志和基因組學(xué)改變等問題。期望建立一種以人源細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料的化學(xué)物致癌性評價簡化模型。 本研究在我室袁素波、陳光宇、周拮等人先后進(jìn)行的賽替派(Thiotepa，TEPA)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphami

3、de，CP)誘發(fā)永生化人支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B惡性轉(zhuǎn)化、裸鼠接種成瘤及轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)化機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，分別以遺傳毒性致癌物賽替派、絲裂霉素C(MitomycinC，MMC)、環(huán)磷酰胺和非遺傳毒性致癌物6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、丁基羥甲苯(butylatedhydroxytoluene，BHT)對BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行染毒，克隆接種。一方面觀察比較所產(chǎn)生的集落形態(tài)學(xué)上的差異，另

4、一方面以電鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、核型分析、基因芯片、裸鼠接種成瘤等技術(shù)對賽替派染毒BEAS-2B后兩種不同形態(tài)集落來源的細(xì)胞的生長特性、細(xì)胞構(gòu)成、遺傳物質(zhì)改變及其致癌性進(jìn)行研究。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 在遺傳毒性致癌物賽替派、環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C染毒BEAS-2B細(xì)胞一定時間后，其傳代細(xì)胞可形成兩種形態(tài)差異很大的集落(克隆)：一種集落與BEAS-2B細(xì)胞集落相似，細(xì)胞呈紡錘形、長梭形，胞核卵圓，胞漿少而淡染，細(xì)胞排列松散，呈放射狀或

5、略呈車輪狀，我們稱之為松散型集落(S-colony)；另一種集落為數(shù)比較少，胞體大而圓，胞漿豐富，核嗜堿深染，細(xì)胞排列緊密，集落呈圓形邊緣向外擴(kuò)展，局部細(xì)胞有復(fù)層生長現(xiàn)象，我們稱之為緊湊型集落(C-colony)。而非遺傳毒性致癌物6-巰基嘌呤、丁基羥甲苯作用BEAS-2B后卻無此現(xiàn)象發(fā)生。提示緊湊型集落的產(chǎn)生與細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷有關(guān)聯(lián)。 我們選取賽替派染毒BEAS-2B細(xì)胞后產(chǎn)生的兩種不同形態(tài)集落(S-colony和C-col

6、ony)及BEAS-2B細(xì)胞，HE染色后，應(yīng)用Mias-300計算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)測量它們的形態(tài)學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)C-colony細(xì)胞在核面積、漿面積、周長、等效直徑等方面大于S-colony和BEAS-2B細(xì)胞，也圓于這兩種細(xì)胞。 把賽替派染毒BEAS-2B細(xì)胞后產(chǎn)生的松散型集落和緊湊型集落分離，擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞建株，分別命名為BEAS-S和BEAS-C細(xì)胞。它們除在細(xì)胞形態(tài)上存在差異外，在細(xì)胞生長動力學(xué)方面也存在差異。BEAS-2

7、B和BEAS-S細(xì)胞生長速率快于BEAS-C細(xì)胞，克隆形成率高于BEAS-C細(xì)胞，飽和密度大于BEAS-C細(xì)胞。但只有BEAS-C細(xì)胞中有緊湊型集落和轉(zhuǎn)化灶產(chǎn)生。BEAS-S、BEAS-C細(xì)胞與BEAS-2B細(xì)胞相比，G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加，G2/M期細(xì)胞比例在其早代細(xì)胞中高于對照細(xì)胞，隨著細(xì)胞傳代，G2/M期細(xì)胞的比例恢復(fù)至正常狀態(tài)，但S期細(xì)胞比例仍高于對照。 對BEAS-2B、BEAS-S和BEAS-C細(xì)胞進(jìn)行考

8、馬斯蘭染色觀察其細(xì)胞骨架，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細(xì)胞骨架系統(tǒng)排列有序，無紊亂；BEAS-S細(xì)胞骨架系統(tǒng)稍有紊亂，不明顯；而BEAS-C細(xì)胞可觀察到骨架系統(tǒng)明顯紊亂。提示賽替派通過對細(xì)胞骨架的影響而使細(xì)胞形態(tài)、集落形態(tài)發(fā)生變化。對BEAS-C細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)賽替派對人支氣管上皮細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用，細(xì)胞損傷比較嚴(yán)重，部分細(xì)胞胞漿、胞核中有空泡，染色質(zhì)有邊集現(xiàn)象。 使用人支氣管上皮基底細(xì)胞特異標(biāo)志物——角蛋白34βE12抗體、杯狀

9、細(xì)胞特異標(biāo)志物——粘蛋白5AC(Mucin5AC，MUC5AC)抗體和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特異標(biāo)志物——嗜鉻素A(ChromograninA，ChrA)抗體對3株細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色(PowerVisionTM兩步法)。發(fā)現(xiàn)在3株細(xì)胞中均無ChrA表達(dá)；MUC5AC表達(dá)為弱陽性；34βE12在BEAS-2B和BEAS-S細(xì)胞中表達(dá)不隨代齡增加而明顯改變，在BEAS-C細(xì)胞，隨著代齡增加，34βE12表達(dá)明顯增強(qiáng)。表明基底細(xì)胞可能是人支氣管

10、上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞。 對3株細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細(xì)胞染色體數(shù)目穩(wěn)定，也未見非穩(wěn)定性畸變；而BEAS-S和BEAS-C細(xì)胞均可見雙著絲粒染色體和少量染色體斷片，發(fā)生率以BEAS-C3P和BEAS-S32P最高，分別為8％和9％。BEAS-C細(xì)胞隨著傳代四倍體的比率逐漸升高，最終成為細(xì)胞的主體，而BEAS-S細(xì)胞染色體數(shù)目的改變不明顯。每株細(xì)胞分析3個核型，其中BEAS-S32P和BEAS-C32P細(xì)胞分

11、別有1個和2個核型異常，以BEAS-C細(xì)胞異常最為明顯。 使用BiostarH-20s基因芯片對3株細(xì)胞部分基因的表達(dá)進(jìn)行兩兩分析比較。將在BEAS-Cvs.BEAS-2B組中出現(xiàn)差異表達(dá)的數(shù)據(jù)項(xiàng)篩出，共44項(xiàng)，其中下調(diào)基因19個，上調(diào)基因25個；將在BEAS-Svs.BEAS-2B組中出現(xiàn)差異表達(dá)的數(shù)據(jù)項(xiàng)篩出，共14項(xiàng)，其中下調(diào)基因8個，上調(diào)基因6個；將在BEAS-Cvs.BEAS-S組中出現(xiàn)差異表達(dá)的數(shù)據(jù)項(xiàng)篩出，共181項(xiàng)，

12、其中下調(diào)基因53個，上調(diào)基因128個。分析結(jié)果還顯示BEAS-C細(xì)胞在某些與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)上異于其它兩株細(xì)胞。我們從基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選取差異明顯的5條基因CTNNB1、CD44、RHOC、ID3、TGFA通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)在它們在3株細(xì)胞中的相對含量用兩種方法所測結(jié)果大體上一致，但在數(shù)值上有些差別。 BEAS-2B、BEAS-S和BEAS-C細(xì)胞在成瘤性上存在差異：PHA(phytohaemagglutin

13、in)凝集實(shí)驗(yàn)中，BEAS-C細(xì)胞凝集性明顯強(qiáng)于BEAS-2B和BEAS-S細(xì)胞；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)中，BEAS-C細(xì)胞在第28代開始長出集落，而BEAS-2B和BEAS-S細(xì)胞在軟瓊脂中始終未觀察到集落形成；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中只有接種BEAS-C細(xì)胞的裸鼠有腫瘤生成。 本研究利用5種致癌物轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞，并對賽替派轉(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞后由不同形態(tài)集落而來的兩株細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞構(gòu)成、基因組學(xué)及成瘤性進(jìn)行研究，得出以下主要

14、結(jié)論：①致癌物→遺傳物質(zhì)的損傷→細(xì)胞骨架系統(tǒng)的紊亂、細(xì)胞黏附性的增加→細(xì)胞形態(tài)、集落形態(tài)的變異→成瘤性的變異。因此緊湊型集落(C-colony)的出現(xiàn)可作為一個預(yù)測化學(xué)物是否具有遺傳毒性、致癌性的早期標(biāo)志，但以此為依據(jù)建立一種以人源細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料的化學(xué)物致癌性評價簡化模型還需在更廣泛的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究。②致癌物→細(xì)胞群中基底細(xì)胞耐受細(xì)胞毒作用→受遺傳毒作用誘導(dǎo)突變→獲得生長優(yōu)勢并擴(kuò)增為惡變細(xì)胞群主體，說明基底細(xì)胞可能是人支氣管上皮細(xì)胞惡性