Bach1、Keap1、PERK、Nrf2調(diào)控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病中的作用.pdf

1、目的:通過觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺內(nèi)紅系衍生核因子相關(guān)因子-2(NF-E2 related factor2,Nrf2)、BTB-CNC異體同源體1(BTB and CNC homology1,Bach1)、Keap1(Kelch-like ECH associating protein1)、PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表達(dá),

2、探索Bach1、Nrf2、Keap1、PERK和γ-GCS在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的作用和意義,并初步探討其作用機(jī)制,為COPD的發(fā)病機(jī)理提供新的理論依據(jù),為其治療提供新的策略和方法。
　　方法:分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)。1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):健康雄性SD大鼠16只,隨機(jī)分COPD模型組和對(duì)照組,每組8只。采用每日熏香煙和兩次氣管內(nèi)滴入脂多糖(LPS)法制作COPD大鼠模型。測(cè)定大鼠肺功能并觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變;檢測(cè)大鼠肺組織

3、中γ-GCS活性,原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肺組織中Nrf2、Bach1、Keap1、γ-GCS mRNA的表達(dá)。免疫組化和免疫印跡(western blot)分析肺組織中γ-GCS與Nrf2、Keap1、Bach1、P-PERK的蛋白水平。2.臨床實(shí)驗(yàn):手術(shù)切除肺癌患者肺組織標(biāo)本18例,所有患者術(shù)前均行肺功能檢測(cè),COPD診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2002年制定的標(biāo)準(zhǔn),其中COPD組和對(duì)照組各9例,RT-PCR檢測(cè)肺組織

4、中Nrf2、Bach1和γ-GCS mRNA的表達(dá),western blot分析肺組織中Bach1、Nrf2和γ-GCS蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.COPD組大鼠FEV0.3和FEV0.3/FVC％較對(duì)照組降低(P<0.05)。肺組織病理學(xué)改變符合COPD的特征性改變。
　　2.COPD組大鼠支氣管上皮細(xì)胞胞漿中γ-GCS和Nrf2mRNA呈強(qiáng)陽性表達(dá);對(duì)照組在相應(yīng)部位呈弱陽表達(dá),兩組圖像吸光度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、(P<0.01), Bach1和Keap1mRNA在兩組中均呈陽性表達(dá),比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RT-PCR顯示,對(duì)照組肺中有一定量γ-GCS和Nrf2mRNA表達(dá),但相對(duì)于COPD組仍較低(P<0.01),Bach1mRNA在兩組中的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.免疫組化顯示:COPD組大鼠支氣管上皮細(xì)胞中Nrf2、γ-GCS和P-PERK蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng);而Bach1和Keap1蛋白表達(dá)與對(duì)

6、照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.核/胞漿蛋白分離及Western blot顯示Nrf2蛋白在對(duì)照組主要表達(dá)于胞漿,在COPD組胞漿、胞核均有表達(dá),且明顯上調(diào),高于對(duì)照組(P<0.01),但是在胞核中的水平明顯升高;Bach1蛋白在對(duì)照組主要表達(dá)于胞核中,在COPD組主要表達(dá)于胞漿,且兩組間無顯著性差異(P>0.05);Keap1在對(duì)照組和COPD組均主要表達(dá)于細(xì)胞漿,兩組間無顯著性差異(P>0.05);P-PERK蛋白在COP

7、D組的表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　5.原位雜交結(jié)果顯示:COPD組患者肺組織中γ-GCS和Nrf2 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而Bach1 mRNA的表達(dá)在兩組中無顯著性差異(P>0.05);免疫組化結(jié)果顯示:Nrf2和γ-GCS蛋白在COPD患者組的肺組織中表達(dá)顯著,與對(duì)照組比較可見差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而Bach1蛋白在COPD患者肺組織中與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

8、　6.SPSS11.0軟件進(jìn)行直線相關(guān)分析,在大鼠和臨床實(shí)驗(yàn)中可見核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)與γ-GCSmRNA及其蛋白表達(dá)呈正相關(guān),p-PERK蛋白表達(dá)與Nrf2蛋白和γ-GCS mRNA表達(dá)均呈正相關(guān),核內(nèi)Bach1/ Nrf2蛋白表達(dá)的比值與γ-GCS的表達(dá)、FEV0.3、FEV0.3/FVC%呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.細(xì)胞核內(nèi)Nrf2和Bach1蛋白水平變化調(diào)控γ-GCS的表達(dá),在COPD氧化/抗氧化失衡機(jī)制中起重要