熊果酸對(duì)大鼠肝纖維化過程中肝細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能機(jī)制.pdf

1、背景：
　　近年研究表明，NADPH氧化酶（NADPHoxidase，NOX）在各種組織、器官的纖維化發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，是開發(fā)抗纖維化藥物的重要新靶點(diǎn)。NOX激活后產(chǎn)生的活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）介導(dǎo)了肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecells，HSCs）內(nèi)的促纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致肝纖維化形成。值得關(guān)注的是，NOX來源的ROS促進(jìn)HSCs增殖、轉(zhuǎn)化并存活，卻誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重

2、肝損傷。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸（ursolicacid，UA）具有的獨(dú)特的抗肝纖維化作用。體外研究發(fā)現(xiàn)UA能選擇性誘導(dǎo)活化型HSCs（HSC-T6細(xì)胞株）凋亡、抑制其增殖，卻不引起肝細(xì)胞凋亡，反促其增殖。體內(nèi)研究表明UA能阻斷脂質(zhì)過氧化，減輕纖維組織增生，并保護(hù)受損的肝細(xì)胞，減少其凋亡與壞死，明顯改善肝纖維化大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)。但熊果酸在肝纖維化過程中保護(hù)肝細(xì)胞的分子機(jī)制尚不明確。
　　我們假說熊果酸保護(hù)肝細(xì)胞的機(jī)制

3、可能是通過抑制肝細(xì)胞的NOX活性減少ROS生成，從而抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞再生。本課題以大鼠原代肝細(xì)胞為研究對(duì)象，以TGF-β1為促纖維化因子，探討熊果酸干預(yù)對(duì)原代肝細(xì)胞NOX活性及ROS生成的影響及其與肝細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系。
　　目的：
　　觀察熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖、凋亡的影響，及熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞NOX活性和ROS生成的影響，闡明熊果酸保護(hù)肝纖維化過程中肝細(xì)胞的可能機(jī)制。<

4、br>　　方法：
　　采用原位灌注法分離提取健康雄性SD大鼠的肝細(xì)胞，接種培養(yǎng)12-24h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成條索狀、島狀，占總面積80％以上時(shí)，隨機(jī)分成以下各組：空白對(duì)照組、熊果酸對(duì)照組（25uM/L）、TGF-β1組（2.5ng/ml）、熊果酸干預(yù)組（熊果酸25uM/L+TGF-β12.5ng/ml）、DPI干預(yù)組（DPI0.5uM/L+TGF-β12.5ng/ml）、Rosup陽性對(duì)照組（10uM/L）。原代肝細(xì)胞經(jīng)藥物作用3

5、0min后采用Western-blotting檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)NOX亞基p47phox向胞膜移位的情況；經(jīng)藥物作用1小時(shí)后采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平；經(jīng)藥物作用6小時(shí)后采用熒光定量PCR檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)CD95mRNA的表達(dá)；經(jīng)藥物作用12小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞增殖、凋亡情況，采用Western-blotting檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)CD95蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1刺激后肝細(xì)胞增殖、凋

6、亡的影響
　　1.1熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1刺激后肝細(xì)胞增殖的影響
　　肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用12h后，其增殖指數(shù)比空白對(duì)照組明顯下降（P<0.01）；熊果酸對(duì)照組的肝細(xì)胞增殖指數(shù)要顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸干預(yù)組的肝細(xì)胞增殖指數(shù)較TGF-β1組明顯增加（P<0.01），與DPI干預(yù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，TGF-β1能抑制原代肝細(xì)胞增殖，而熊果酸干預(yù)能明顯減弱TGF-β1對(duì)肝細(xì)胞

7、增殖的抑制作用，并促進(jìn)肝細(xì)胞再生。
　　1.2熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的影響
　　肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用12h后，其凋亡率比空白對(duì)照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對(duì)照組的肝細(xì)胞凋亡率要明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸干預(yù)組的肝細(xì)胞凋亡率較TGF-β1組明顯降低（P<0.01），與DPI干預(yù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明，TGF-β1誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞凋亡，而熊果酸干預(yù)能明顯減少T

8、GF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。
　　1.3熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)CD95mRNA表達(dá)的影響
　　肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用6h后，細(xì)胞內(nèi)CD95mRNA的表達(dá)比空白對(duì)照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對(duì)照組CD95mRNA的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸干預(yù)組CD95mRNA水平較TGF-β1組顯著降低（P<0.01），與DPI干預(yù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸干預(yù)能明顯

9、下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的CD95mRNA的表達(dá)。
　　1.4熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)CD95蛋白表達(dá)的影響
　　肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用12h后，細(xì)胞內(nèi)CD95蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對(duì)照組CD95蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組（P<0.05）；熊果酸干預(yù)組CD95蛋白表達(dá)水平較TGF-β1組有所降低（P<0.05），與DPI干預(yù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果說明熊果酸干預(yù)能下調(diào)

10、TGF-β1誘導(dǎo)的CD95蛋白的表達(dá)。
　　2.熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)NOX亞基p47phox膜移位的影響
　　肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用30min后，其p47phox亞基的膜移位比空白對(duì)照組顯著增加（P<0.01）；熊果酸對(duì)照組p47phox亞基膜移位明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；熊果酸干預(yù)組p47phox亞基膜移位較TGF-β1組顯著降低（P<0.01），與DPI干預(yù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）

11、。以上結(jié)果說明熊果酸干預(yù)能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的p47phox亞基向膜移位，從而抑制肝細(xì)胞內(nèi)NOX活性。
　　3.熊果酸干預(yù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響
　　肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用1h后，其DCF熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組明顯增加（P<0.01），與Rosup陽性對(duì)照組相比無顯著性差異（P>0.05）；熊果酸對(duì)照組熒光強(qiáng)度明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；熊果酸干預(yù)組熒光強(qiáng)度較TGF-β1組顯著降低（P<0.0