鱉甲煎改良方對(duì)大鼠肝纖維化的防治作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理過(guò)程，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)病理階段，防治肝纖維化是攻克肝硬化的突破口，從中醫(yī)藥中尋求有效的治療方法具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）是一類(lèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽，具有活化肝星型細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC），促進(jìn)肝臟膠原基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracel

2、lular matrix，ECM）合成等作用，是最重要的促肝纖維化因子之一。采用四氯化碳（carbon tetrachloride4，CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，觀察鱉甲煎改良方對(duì)大鼠肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）的防治作用及對(duì)TGF-β1、smad3和smad7蛋白及mRNA表達(dá)情況，探討其抗肝纖維化分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1．肝纖維化模型制備：SD 雄性大鼠90只，隨機(jī)取10只作為正常

3、對(duì)照組（A），其余大鼠用皮下注射40％四氯化碳（CCl4）橄欖油油劑0.3mL/100g 誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型8周，于第2周時(shí)隨機(jī)處死5只證實(shí)HF 形成后隨機(jī)分為肝纖維化模型組（B）、鱉甲煎改良方高劑量組（C）28.4g/（kg?d）、中劑量組（D）14.2g/（kg?d）、低劑量組（E）7.1g/（kg?d）、復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)照組（F）0.6g/（kg?d），每組15只。鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組給予1mL/（10

4、0g?d）相應(yīng)藥液灌胃治療，A、B組同時(shí)給予等劑量的生理鹽水灌胃處理。
　　 2．標(biāo)本收集及處理：8周后各組大鼠在3％戊巴比妥鈉以1ml/kg 體重腹腔注射麻醉，經(jīng)股動(dòng)脈采血測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin）和球蛋白（globulin）含量；并取同一部位肝組織用10％中性福

5、爾馬林固定，24小時(shí)后逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，包埋、切片，作HE（hematoxylin-eosin）染色觀察肝纖維化程度變化并且運(yùn)用免疫組化方法分析轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor betaone，TGF-β1）、Smad3及Smad7表達(dá)；取肝右葉組織二塊放入液氮罐中保存用以提取組織RNA及蛋白質(zhì)。
　　 3．主要觀測(cè)指標(biāo)與方法：試驗(yàn)中每天觀察大鼠一般情況并稱(chēng)重，應(yīng)用EX7 全自動(dòng)生化

6、測(cè)定儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白、球蛋白含量；HE 染色觀察肝纖維化程度，reverse transcriptase polymerase chainreaction（RT-PCR）檢測(cè)其轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1、受體Ⅰ、受體Ⅱ、Smad3及Smad7mRNA基因表達(dá)變化，免疫組織化學(xué)方法和Western-blot方法檢測(cè)各組組織中TGF-β1、smad3和smad7蛋白表達(dá)。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1．8周后，成功復(fù)制大鼠肝纖維化模型，模型組肝纖維化形成明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝組織中膠原纖維含量和沉積明顯增加。與模型組比較，鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，肝纖維化程度分級(jí)較模型組明顯好轉(zhuǎn)，膠原纖維所占面積顯著縮?。?3、24、24、26vs50）；模型組、鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組ALT和AST 含量顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）且模型組最高，

8、顯著高于其他各組（P<0.01），白蛋白含量則明顯低于正常對(duì)照組（P<0.01），模型組更低于其他各組（P<0.01）；鱉甲煎改良方高、中、低劑量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與復(fù)方鱉甲軟肝片組比較有顯著差異（P<0.01）；各組球蛋白含量比較均無(wú)顯著性差異。
　　 2.RT-PCR 結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織三種基因都有較低水平的表達(dá)，而模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，smad7表達(dá)明顯減弱，與模型組

9、比較，鱉甲煎改良方高、中、低劑量組與復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3表達(dá)減少（TGF-β1：0.3230±0.0039、0.3275±0.0057、0.3232±0.0035、0.3665±0.0158vs0.8761±0.0140；Smad3：0.1027±0.0043、0.0935±0.0046、0.1025±0.0019、0.1257±0.0030vs0.8105±0.0070），smad7表達(dá)明顯增強(qiáng)（0.51

10、00±0.0009、0.5099±0.0070、0.5093±0.0023、0.4979±0.0093vs0.1166±0.0128）。
　　 2．免疫組化及Western-blot 結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織有較少TGF-β1、smad3和smad7表達(dá)，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而smad7表達(dá)明顯減弱；與模型組相比，鱉甲煎改良方各濃度組與復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3表達(dá)

11、顯著減少（Western-blot：TGF-β1：0.127±0.014、0.122±0.051、0.126±0.027、0.119±0.020vs0.332±0.074，P<0.01；Smad3：0.415±0.057、0.427±
　　 0.074、0.425±0.080、0.432±0.075vs0.527±0.054，P<0.01），smad7蛋白的表達(dá)明顯增加（Western-blot：0.308±0.077、0.32

12、6±0.086、0.315±0.071、0.348±0.065vs0.185±0.059，P<0.01），且鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組間療效比較無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 鱉甲煎改良方能夠顯著減輕CCl4 導(dǎo)致的大鼠肝纖維化程度，減少膠原纖維沉積和防止肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，顯著改善大鼠肝功能，尤其降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量，并且能夠明顯抑制大鼠肝組織中TGF-β1和Smad3 mR