血管緊張素Ⅱ促進microRNA-21的表達激活SMAD通路導致肝纖維化的作用及機制.pdf

1、研究背景:肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性致病因素引起的肝臟損傷和炎癥后組織修復過程中的代償反應，以細胞外基質(EMC)在肝內的過量沉積為病理特征，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經途徑。
　　 眾多研究表明，局部組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與肝纖維化密切相關，RAS在肝纖維化組織中顯著上調，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的重要組分，可刺激肝星狀細胞增殖和膠原纖維的合成，因此AngⅡ是促肝纖維化的重要物質。近年來，

2、RAS的另一個新發(fā)現(xiàn)的重要組分:血管緊張素轉換酶2(ACE2)-血管緊張素1-7(Ang(1-7)）-Mas受體軸引起人們的關注。該軸對ACE-AngⅡ-AT1R軸具有負調控作用，兩個軸之間的平衡狀態(tài)可能影響了肝纖維化的發(fā)展。
　　 肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化發(fā)生過程的中的關鍵細胞。HSC被肝損傷相關的炎癥反應激活后，大量增殖分化，分泌過量的細胞外基質，最終引起肝纖維化。HSC主要通過TGF-β/Smad通路激活。TGF-β

3、的受體二聚化后，磷酸化的Smad2/3，在Smad4的參與下啟動纖維化的相關基因表達。Smad7可通過抑制Smad2/3的磷酸化抑制該過程。
　　 盡管人們對肝纖維化發(fā)生的基本病理過程和信號通路已有所了解，但臨床上仍缺少治療肝纖維化的特效藥物。針對TGF-β和SMAD通路的生物抑制劑還停留在實驗研究階段，未能大規(guī)模應用于臨床。因此，尋找肝纖維化防治過程的新靶點和新策略依然是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。
　　 MicroRNA(m

4、irRNA)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，由呈發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成。miRNA參與多種疾病的病理過程，是疾病重要的候選診斷標志和潛在的治療靶點。miRNA在細胞內具有多種重要的調節(jié)作用，能對靶基因進行轉錄后調控。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調節(jié)同一個基因。這種復雜的調節(jié)網(wǎng)絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個mi

5、RNAs的組合來精細調控某個基因的表達。miRNA能夠與其序列互補的mRNA分子相結合，甚至可以與特定的DNA片斷結合，導致目的基因的沉默。這種方式是機體調節(jié)基因表達的一個重要策略。據(jù)推測，miRNA調節(jié)人類三分之一的基因。mirRNA的研究多見于腫瘤方面，在器官纖維化方面的研究還相對較少。
　　 本論文主要針對AngⅡ是否通過促進mir-21表達，調控SMAD通路關鍵信號分子，進而促進肝纖維化展開研究，闡明mir-21在肝纖維

6、化發(fā)生過程中的關鍵作用。同時探明AngⅡ激活轉錄因子AP-1以及SMAD3、SMAD2從而誘導mir-21的表達作用機理。討論mir-21作為治療肝纖維化的潛在靶點。
　　 目的:研究在體內以及體外實驗中，AngⅡ是否通過促進mir-21表達，調控SMAD通路關鍵信號分子，進而促進肝纖維化展開研究，闡明mir-21在肝纖維化發(fā)生過程中的關鍵作用，同時探明AngⅡ激活轉錄因子AP-1以及SMAD3、SMAD2從而誘導mir-21的

7、表達作用機理。
　　 方法:常規(guī)培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞T6細胞系，根據(jù)實驗目的不同進行下述不同的實驗:
　　 1、不同濃度的AngⅡ分別刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系6小時，通過熒光定量PCR檢測到micro-21的表達量的變化;大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為對照組、10-5 mol/L AngⅡ處理組、10-7 mol/L AngⅡ處理組、10-9 mol/L AngⅡ處理組，實驗重復3次。
　　 2、10-7 mo

8、l/L AngⅡ分別于不同時間點刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系，通過熒光定量PCR檢測到micro-21的表達量的變化，大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為AngⅡ刺激0小時組、AngⅡ刺激6小時組、AngⅡ刺激24小時組，實驗重復3次。
　　 3、不同濃度的Ang（1-7）分別刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系6小時，通過熒光定量PCR檢測到micro-21的表達量的變化;大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為對照組、10-5 mol/L Ang(1-

9、7)處理組、10-7 mol/L Ang(1-7)處理組、10-9 mol/L Ang(1-7)處理組，實驗重復3次。
　　 4、10-7 mol/L Ang（1-7）分別于不同時間點刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系，通過熒光定量PCR檢測到micro-21的表達量的變化，大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為AngⅡ刺激0小時組、Ang(1-7)刺激6小時組、Ang(1-7)刺激24小時組，實驗重復3次5、大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為對照組

10、、AngⅡ刺激組、Ang(1-7)刺激組、AngⅡ+Ang(1-7)刺激組，通過熒光定量PCR檢測到micro-21的表達量的變化，實驗重復3次。
　　 6、分別用NC、microRNA-21前體（pre-microRNA-21）或者microRNA-21抑制劑（anti-microRNA-21）轉染大鼠肝星狀細胞T6細胞系72小時，用免疫印跡方法(Western Blot)法檢測α-平滑肌蛋白(α-SMA)、結締組織(CTGF

11、)、SMAD7、Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen)蛋白水平的變化，實驗重復3次。
　　 7、大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為pre-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激0分鐘組、pre-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激0分鐘、pre-microRNA-2t轉染對照+AngⅡ刺激5分鐘組、pre-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激5分鐘組，以及anti-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激0分鐘組、

12、anti-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激0分鐘組、anti-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激5分鐘、anti-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激5分鐘組，用免疫印跡方法(Western Blot)法檢測磷酸化的SMAD2(p-SMA2)、磷酸化的SMAD3(p-SMA3)蛋白表達水平的變化，實驗重復3次。
　　 8、大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為對照組、SMAD2-siRNA組、對照+AngⅡ刺激組SM

13、AD2-siRNA+AngⅡ刺激組，或者對照組、SMAD3-siRNA組、對照+AngⅡ刺激組、SMAD3-siRNA+AngⅡ刺激組，培養(yǎng)6小時后通過熒光定量PCR檢測到microRNA-21的表達量的變化，實驗重復3次。
　　 9、大鼠肝星狀細胞T6細胞系分為野生質粒轉染對照+轉染microRNA-21mimics組、轉染Smad73'UTR野生型質粒+轉染microRNA-21 mimics組，或者突變質粒轉染對照+轉染m

14、icroRNA-21 mimics組、轉染Smad73'UTR突變型質粒+轉染microRNA-21 mimics組，培養(yǎng)48小時后檢測細胞的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值變化，miRNA-21特點主要是通過與靶基因3'UTR結合來調控靶基因的表達。將Smad7基因的3'UTR區(qū)克隆至載體上海腎熒光素酶基因(hRluc)下游位點，以海腎熒光素酶基因作為報告基因，以螢火蟲熒光素酶基因(hLuc)作為內參基因，通過檢測海腎熒光素酶活性的相對變化

15、情況來鑒定miRNA-21對該基因是否有調控作用。實驗重復3次。
　　 Wistar大鼠根據(jù)不同實驗目的進行下述不同的實驗:
　　 10、Wistar大鼠分為假手術組（SHAM組）、膽管結扎組（BDL組）、以及BDL+Ang(1-7)組，4周后取肝組織，通過HE染色評價肝組織纖維化評分、masson染色計算膠原面積、做羥脯氨酸測定、α-SMA的免疫組化、microRNA-21的原位雜交試驗。
　　 11、Wist

16、ar大鼠分為假手術組（SHAM組）、膽管結扎組（BDL組）、以及BDL+Ang(1-7)組，4周后取肝組織，提取總RNA，通過熒光定量PCR檢測各組microRNA-21基因表達量的變化，判斷Ang(1-7)對膽管結扎大鼠肝纖維化的抑制作用。
　　 12、Wistar大鼠分為假手術組（SHAM組）、AngⅡ刺激組、Ang（1-7）刺激組、AngⅡ+Ang（1-7）刺激組，4周后取肝組織，通過HE染色評價肝組織纖維化評分、mass

17、on染色計算膠原面積、做羥脯氨酸測定、α-SMA的免疫組化。
　　 13、Wistar大鼠分為假手術組（SHAM組）、AngⅡ刺激組、Ang（1-7）刺激組、AngⅡ+Ang（1-7）刺激組，分別用生理鹽水、AngⅡ、Ang（1-7）、AngⅡ+Ang（1-7）以每小時25ug/kg速度持續(xù)腹腔泵入，4周后取大鼠肝組織，提取總RNA，通過熒光定量PCR檢測各組microRNA-21表達量的變化，初步證實AngⅡ可以促進micro

18、RNA-21表達進而引起肝纖維化。
　　 結果:
　　 1、與對照組相比，10-5 mol/L AngⅡ、10-7 mol/L AngⅡ、10-9 mol/L AngⅡ刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系6小時后，細胞中microRNA-21的表達量均明顯增加(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，而10-7 mol/L AngⅡ刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系引起的microRNA-21的表達量增加效果最為顯著。
　　

19、 2、培養(yǎng)6小時，與control組相比，10-7 mol/L AngⅡ刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系后，通過熒光定量PCR檢測到microRNA-21的表達量明顯增高(P＜0.05);培養(yǎng)24小時與培養(yǎng)6小時相比，大鼠肝星狀細胞T6 microRNA-21的表達量有所下降(P＜0.05)。
　　 3、與對照組相比，10-7 mol/L Ang(1-7)刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系6小時后，細胞中microRNA-21的表達量均

20、明顯降低(P＜0.05)，而10-5 mol/LAng(1-7)處理組、10-9 mol/L Ang(1-7)處理組刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系引起的microRNA-21的表達量無明顯改變(P=0.224，P=0.286)。
　　 4、培養(yǎng)6小時，與control組相比，10-7 mol/L Ang（1-7）刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系后，通過熒光定量PCR檢測到microRNA-21的表達量明顯降低;培養(yǎng)24小時后，與con

21、trol組相比，10-7 mol/L Ang(1-7)刺激大鼠肝星狀細胞T6細胞系后通過熒光定量PCR檢測到microRNA-21的表達量無明顯改變(P=0.230);培養(yǎng)6小時與培養(yǎng)24小時相比，大鼠肝星狀細胞T6microRNA-21的表達量明顯降低。
　　 5、與對照組相比，AngⅡ刺激組中microRNA-21的表達量增加，與AngⅡ刺激組比，AngⅡ+Ang(1-7)刺激組細胞microRNA-21的表達量下降。

22、>　　 6、大鼠肝星狀細胞T6細胞系培養(yǎng)72小時后，與對照組相比，用microRNA-21前體（pre-microRNA-21）轉染組細胞中α-SMA、CTGF、typeⅠ collagen蛋白表達增加而SMAD7蛋白表達降低。而用microRNA-21抑制劑（anti-microRNA-21）轉染組細胞中α-SMA、CTGF、typeⅠ collagen蛋白表達降低而SMAD7蛋白表達升高。
　　 7、與pre-microR

23、NA-21轉染對照+AngⅡ刺激0分鐘組相比，pre-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激0分鐘組細胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表達增高;與pre-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激0分鐘組相比，pre-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激5分鐘組細胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表達增高;與pre-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激5分鐘組相比，pre-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激5

24、分鐘組細胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表達增高，差異有統(tǒng)計學意義;與anti-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激0分鐘組相比，anti-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激0分鐘組細胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表達降低;與anti-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激0分鐘組相比，anti-microRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激5分鐘組細胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表達增高;與anti-mic

25、roRNA-21轉染對照+AngⅡ刺激5分鐘組相比，anti-microRNA-21轉染+AngⅡ刺激5分鐘組細胞p-SMAD2、p-SMA3蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 8、與對照組相比，SMAD2-siRNA組microRNA-21表達量下降(P＜0.05);對照+AngⅡ刺激組microRNA-21表達量增加(P＜0.05)。與SMA02-siRNA組相比，SMAD2-siRNA+AngⅡ刺激組microRNA-

26、21表達量增加(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義;與對照組相比，SMAD3-siRNA組microRNA-21表達量下降(P＜0.05);對照+AngⅡ刺激組microRNA-21表達量升高(P＜0.05)。與SMAD3-siRNA組相比，SMAD3-siRNA+AngⅡ刺激組microRNA-21表達量變化不明顯(P=0.571)，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 9、培養(yǎng)48小時后，與野生質粒轉染對照+轉染microRNA-21 m

27、imics組相比，轉染Smad73'UTR野生型質粒+轉染microRNA-21 mimics組細胞的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值降低(P＜0.05));而與突變質粒轉染對照+轉染microRNA-21 mimics組、轉染Smad73'UTR突變型質粒+轉染microRNA-21 mimics組細胞的海腎素熒光與螢火蟲熒光比值改變無明顯改變(P=0.605)。
　　 10、在假手術組（SHAM組）、膽管結扎組（BDL組）、以及B

28、DL+Ang(1-7)組中，與SHAM組相比，BDL組中肝纖維化評分、膠原面積、羥脯氨酸含量、α-SMA的含量均增高(P＜0.05);與BDL組相比，BDL+Ang(1-7)組中肝纖維化評分、膠原面積、羥脯氨酸含量、α-SMA的含量均降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。原位雜交實驗分析示:與SHAM組相比，BDL組中表達microRNA-21的細胞明顯增多;與BDL組相比，BDL+Ang(1-7)組中表達microRNA-21的細胞

29、明顯減少。
　　 11、在假手術組（SHAM組）、膽管結扎組（BDL組）、以及BDL+Ang(1-7)組中，與SHAM組相比，BDL組中microRNA-21的表達明顯增高(P＜0.001);與BDL組相比，BDL+Ang(1-7)組中microRNA-21的表達明顯降低(P＜0.001)。
　　 12、與SHAM組相比，AngⅡ刺激組大鼠肝組織中肝纖維化評分、膠原面積、羥脯氨酸含量、α-SMA的含量均增高(P＜0.05

30、);與AngⅡ刺激組相比，AngⅡ+Ang（1-7）刺激組大鼠肝組織中肝纖維化評分、膠原面積、羥脯氨酸含量、α-SMA的含量均降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 13、與SHAM組相比，AngⅡ刺激組大鼠肝組織中microRNA-21的表達明顯增高(P＜0.001)，與AngⅡ刺激組相比，AngⅡ+Ang（1-7）刺激組大鼠肝組織中microRNA-21的表達明顯降低(P＜0.001)，差異有統(tǒng)計學意義。