木賊抗氧化損傷作用的有效部位提取及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用.pdf

1、目的：提取、分離并測(cè)定木賊(Equisetum)中抗氧化損傷作用的有效部位。觀察其對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷后細(xì)胞增殖與凋亡的影響，以進(jìn)一步確認(rèn)木賊保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)早期損傷的有效部位及機(jī)制。 方法： 第一部分 1.木賊有效部位的提取和分離 稱取適量木賊飲片加12倍量的70％乙醇，電熱套加熱回流提取3次，每次2h

2、，過濾得提取液。分批將提取液減壓濃縮，經(jīng)大孔樹脂分別以蒸餾水、30％乙醇及70％乙醇洗脫分離。收集70％乙醇洗脫液作為有效部位測(cè)試樣品。 2.木賊有效部位含量的測(cè)定 將槲皮素和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同倍數(shù)濃度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得回歸方程。用同樣方法檢測(cè)提取樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程得出其中有效部位(總黃酮和總酚酸)含量。精量一定體積的提取樣品，將其烘干達(dá)恒重，用所測(cè)有效部位含量與之相比，以計(jì)算所

3、含有效部位純度。 3. 干預(yù)細(xì)胞藥物溶液的配置 將一定量濃縮液用用二甲基亞砜(DMSO)充分溶解后加入無血清培養(yǎng)基DMEM配成所需濃度(500μg/ml)藥物溶液，滅菌、-20℃保存?zhèn)溆谩?第二部分 1.低密度脂蛋白的分離、氧化和鑒定 采用化學(xué)沉淀法提取低密度脂蛋白(LDL)。將LDL置于10μmol/L濃度CuSO4溶液中37℃氧化24h，經(jīng)PH7.4 PBS透析24h，過濾除菌，得ox-LDL

4、，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外分光法監(jiān)測(cè)氧化過程及氧化程度，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濃度。 2.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株復(fù)蘇后于含15％新生小牛血清的DMEM中培養(yǎng)，胰酶法消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分成對(duì)照組、氧化損傷組、木賊提取物干預(yù)組。將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清DMEM，培養(yǎng)6h后對(duì)照組與損傷組分別加入無血清DMEM，木賊提取物干預(yù)組加入等量木賊有效部位藥物溶液(終濃度為50μg/ml)。繼續(xù)

5、培養(yǎng)1h后木賊提取物干預(yù)組與損傷組分別加入ox-LDL(終濃度為80μg/ml)，對(duì)照組加入無血清DMEM。共培養(yǎng)12小時(shí)后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液用于檢測(cè)。 3.指標(biāo)檢測(cè) 分別于倒置顯微鏡及掃描電鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期及Caspase-3蛋白表達(dá)量，半定量RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3mRNA、Bax mRNA和Bcl-2 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果: 第一部分

6、 1.木賊中總黃酮和總酚酸的含量： 以槲皮素計(jì)單位質(zhì)量木賊中總黃酮含量為1.69mg/g，以阿魏酸計(jì)單位質(zhì)量木賊中總酚酸含量為1.23mg/g；單位質(zhì)量木賊中總黃酮與總酚酸合計(jì)平均含量為2.92mg/g。 2.木賊有效部位的純度：為63.28％。 第二部分 1.形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，貼壁牢固，細(xì)胞間連接緊密，呈單層鋪路石樣鑲嵌排列；損傷組細(xì)胞形態(tài)改變明顯，細(xì)胞收縮

7、、變圓，胞體變小，連接疏松，較多細(xì)胞脫落：木賊提取物干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于損傷組，數(shù)量較多，呈單層鋪路石樣鑲嵌排列，似對(duì)照組。掃描電鏡下對(duì)照組細(xì)胞外形飽滿、胞質(zhì)豐富，細(xì)胞間連接緊密；損傷組細(xì)胞表面有泡狀突起及凹陷空洞形成多呈凋亡狀態(tài)；木賊提取物干預(yù)組組細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，外形飽滿，胞質(zhì)豐富。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞周期的改變 與對(duì)照組比較，損傷組停留在G0/G1期細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)，S和G2/M期細(xì)胞減少

8、；與損傷組相比，木賊提取物干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)則顯著降低(P＜0.01)，S和G2/M期比例均升高。損傷組內(nèi)皮細(xì)胞增值指數(shù)PI較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，木賊提取物干預(yù)組PI較損傷組則明顯升高(P＜0.01)。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的改變 損傷組內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡率與對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.01)，而木賊提取物干預(yù)組調(diào)亡率則比損傷組明顯降低(P＜0.01)。 4.木賊有效部位對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Ca

9、spase-3蛋白及Caspase-3mRNA表達(dá)的影響 Caspase-3蛋白及Caspase-3mRNA在損傷組的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；而兩者在木賊提取物干預(yù)組則比損傷組明顯降低(P＜0.01)。 5.木賊有效部位對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 損傷組內(nèi)皮細(xì)胞Bax mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；與損傷組相比，木賊提取物干預(yù)組Bax mRNA的表達(dá)明

10、顯降低(P＜0.01)。Bcl-2 mRNA的表達(dá)與上述趨勢(shì)相反。Bax/Bcl-2比值各組問差異更為明顯，損傷組遠(yuǎn)高于對(duì)照組(P＜0.01)，木賊提取物干預(yù)組則顯著降低(P＜0.01)。 結(jié)論： 通過此工藝流程，得到了較高純度的總黃酮和總酚酸，達(dá)到作為有效部位的標(biāo)準(zhǔn)。通過其干預(yù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)木賊提取物可通過多途徑抑制ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗早期AS作用，推測(cè)提取物中黃酮類及酚酸類化合物即為有效部位的藥