胰島素樣生長因子-Ⅰ預防酒精引起成骨細胞抑制及凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景:過量飲酒是當今世界范圍內(nèi)一個重要的社會公共衛(wèi)生問題，且飲酒的年輕人越來越多。長期大量飲酒對骨骼系統(tǒng)有損害作用，但其機制仍不十分清楚。酒精對成骨細胞有直接作用，慢性飲酒者存在的營養(yǎng)不良及小血管病變，加重了酒精的毒性作用。血清饑餓條件下，體外培養(yǎng)成骨細胞在酒精干預后增殖和功能的改變，直接反映了體內(nèi)損傷機制。慢性飲酒人群血清胰島素樣生長因子-I(IGF-I)水平降低，酒精還抑制了IGF-I受體酪氨酸激酶磷酸化。IGF-I促進成骨細胞

2、的增殖和分化，外源性IGF-I對成骨細胞的保護可能使其成為預防和治療酒精引起骨損害的有效方法。凋亡是細胞在不同條件下進行的自發(fā)性死亡，多種因素對凋亡的影響調(diào)節(jié)了成骨細胞活性。Bcl-2、Bax分別是凋亡抑制基因和凋亡促進基因的代表，其表達決定了凋亡的發(fā)生。 第一章大鼠成骨細胞體外分離培養(yǎng)及其功能鑒定 目的：改良組織塊培養(yǎng)法，體外分離培養(yǎng)新生大鼠成骨細胞，進行功能鑒定，為實驗研究提供高純度的成骨細胞。 方法：無菌條

3、件下取新生大鼠顱骨骨片，首先以0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化20 min，再按照傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法操作，接種到含15％新生牛血清DMEM中，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察。將分離的細胞采用差速黏附法純化后傳代培養(yǎng)，分別進行I型膠原SP法免疫細胞化學染色，細胞內(nèi)堿性磷酸酶鈣鈷法染色，鈣結(jié)節(jié)茜素紅S染色，細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性測定，RT-PCR檢測骨鈣素mRNA表達。 結(jié)論：改良組織塊培養(yǎng)法能獲得大量高純

4、度的成骨細胞，操作方便。多種方法聯(lián)合應用可作為體外培養(yǎng)成骨細胞的鑒定標準。培養(yǎng)所得成骨細胞在傳代過程中保持成骨細胞特性，可供實驗研究使用。 第二章IGF-I對酒精抑制體外培養(yǎng)成骨細胞增殖和功能的影響 目的：探討成骨細胞在體外正常血清濃度條件下和血清饑餓條件下的增殖和功能情況，以及酒精對兩種條件下培養(yǎng)成骨細胞的影響和IGF-I的保護作用。 方法：應用改良組織塊培養(yǎng)法體外分離純化的新生大鼠成骨細胞，以不同酒精濃度進

5、行干預，MTT法檢測細胞增殖改變，確定適合的濃度。分6組在不同條件下進行培養(yǎng)，分別為正常血清濃度組，正常血清濃度加酒精組，血清饑餓組，血清饑餓加酒精組，血清饑餓加IGF-I組和血清饑餓加IGF-I加酒精組，酒精濃度為100 mM。MTT法檢測細胞增殖，堿性磷酸酶檢測試劑盒測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性變化，RT-PCR法檢測骨鈣素mRNA表達。 結(jié)論：酒精能引起成骨細胞增殖和功能抑制，加重血清饑餓對成骨細胞的抑制作用，可能是酒精性骨損

6、害的機制之一。IGF-I能改善血清饑餓引起的成骨抑制，并抵抗酒精抑制細胞增殖的作用，可能成為探索治療酒精性骨損害的途徑之一。 第三章IGF-I對酒精誘導體外培養(yǎng)成骨細胞凋亡及其相關基因Bcl-2、Bax mRNA表達的影響 目的：從細胞凋亡的角度探討酒精對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖和功能抑制的相關機制。了解凋亡相關基因Bcl-2、Bax mRNA表達變化情況，以及IGF-I的作用。 方法：利用體外培養(yǎng)方法，對成骨細胞采

7、用不同干預，AO／EB染色觀察細胞凋亡形態(tài)學改變，DNALadder檢測凋亡細胞DNA片段形成，流式細胞技術(shù)分析測定細胞凋亡率。RT-PCR檢測細胞凋亡相關基因Bel-2、Bax mRNA表達。 結(jié)論：酒精引起體外培養(yǎng)成骨細胞凋亡，在酒精性骨損害的發(fā)生中起重要的作用。血清饑餓引起凋亡主要由于下調(diào)Bcl-2 mRNA表達，酒精引起成骨細胞凋亡與Bcl-2 mRNA表達下調(diào)和Bax mRNA表達上調(diào)有關。IGF-I同時調(diào)節(jié)Bcl-2