Kruppel樣因子4在實驗性肺纖維化中的表達及干預(yù)研究.pdf

1、目的:特發(fā)性肺纖維化（idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF）是一種病因不明的慢性間質(zhì)性肺疾病，其發(fā)病機制尚未明確，以早期的肺泡炎癥和晚期的纖維增生為主要特征。他汀類藥物是一類3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA，HMG-CoA）還原酶抑制劑，通過對HMG-CoA還原酶的抑制作用，使血清膽固醇合成減少。他汀類藥物除降脂作用外，還具有抗炎、抗氧化、

2、抗血小板凝集、改善內(nèi)皮功能等作用，既往研究已表明他汀類的抗炎作用可改善肺臟、肝臟、腎臟等的纖維化，但其作用機制尚不明確。Krüppel樣因子4(Krüppel-likefactor4，KLF4)是在多種組織中廣泛表達的、具有雙重功能的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞的生長、增殖、分化和凋亡等眾多生理活動中起著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，KLF4與心血管疾病、腫瘤和炎性疾病等均有密切關(guān)系，而KLF4在炎癥反應(yīng)中的作用主要表現(xiàn)為對單核巨噬細胞表型偏移的調(diào)節(jié)。

3、為了探討KLF4在阿托伐他汀抑制實驗性肺纖維化中的作用，本研究擬通過支氣管滴注法建立小鼠肺纖維化模型，以觀察KLF4基因和蛋白在肺纖維化小鼠肺組織中的表達，通過阿托伐他汀干預(yù)肺纖維化小鼠，觀察阿托伐他汀干預(yù)后肺纖維化小鼠肺組織中KLF4的表達變化，并通過RNA干擾技術(shù)敲除巨噬細胞RAW264.7KLF4基因，觀察KLF4對巨噬細胞細胞增殖、凋亡及細胞表型的影響，進一步探討KLF4在阿托伐他汀改善實驗性肺纖維化過程中的作用機制。
　

4、　 第一部分，KLF4在實驗性肺纖維化小鼠肺組織中的動態(tài)表達
　　 方法:
　　 1.C57BL/6小鼠隨機分為生理鹽水對照組（Control）和博萊霉素組(BLM)，經(jīng)氣管內(nèi)注入博萊霉素(2.5mg/kg)建立實驗性小鼠肺纖維化模型，經(jīng)氣管內(nèi)注入等量生理鹽水作為對照組，分別于術(shù)后第12h、1d、2d、3d、7d、14d、28d取材;
　　 2.采用HE染色和Masson染色觀察肺組織病理變化及膠原的沉積部位和

5、數(shù)量;
　　 3.實時定量PCR法檢測各組肺組織中KLF4mRNA表達水平;
　　 4.免疫組織化學(xué)法檢測各組肺組織中KLF4蛋白表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化過程中，第1、2、3天表現(xiàn)為急性炎癥，第7天炎癥加重，并出現(xiàn)膠原沉積，第14天肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，膠原沉積明顯，第28天肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，炎癥程度和膠原沉積較輕;
　　 2.與對照組相比，BLM組小鼠肺組織中KLF

6、4mRNA的表達水平第1天開始升高，而后降低，第3天達最低后逐漸升高直至第28天。
　　 3.與對照組相比，BLM組小鼠肺組織中KLF4蛋白的表達水平與mRNA表達趨勢基本一致，第1天開始升高，而后降低，第3天達最低后逐漸升高至第14天后再次下降。
　　 第二部分，阿托伐他汀對實驗性肺纖維化小鼠肺組織中KLF4表達變化的影響
　　 方法:
　　 1.將C57BL/6小鼠隨機分為對照組(Control)、博

7、萊霉素組(BLM)和阿托伐他汀組(ATO)，BLM組和ATO組一次性經(jīng)氣管內(nèi)注入博萊霉素(2.5mg/kg)建立實驗性小鼠肺纖維化模型，對照組注入等量生理鹽水。ATO組在氣管滴注BLM后給予阿托伐他汀灌胃10mg/(kg·d)，分別于術(shù)后第3d、14d、28d取材;
　　 2.采用HE染色、Masson染色的方法觀察肺組織病理變化及膠原的沉積部位和數(shù)量;
　　 3.實時定量PCR法檢測各組肺組織中KLF4mRNA表達水平

8、;
　　 4.免疫組織化學(xué)法檢測各組肺組織中KLF4蛋白表達水平;
　　 5.明膠酶譜分析法檢測各組肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.病理結(jié)果顯示ATO組較BLM組炎癥程度和膠原沉積明顯減輕。
　　 2.與BLM組(0.336±0.195)相比，ATO組(2.050±1.564)KLF4mRNA表達水平第3天

9、明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，第14天ATO組(0.464±0.110)較BLM組(2.000±0.435)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.與BLM組相比，各時間點ATO組KLF4蛋白表達水平均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.BLM組MMP-2活性較對照組明顯上調(diào)，阿托伐他汀干預(yù)后MMP-2的活性明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 第三部分

10、，KLF4對巨噬細胞細胞增殖、凋亡及表型偏移的影響
　　 方法:
　　 1.通過LipofectamineTM2000將短發(fā)夾RNA(shorthairpin，shRNA)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定細胞株，獲得的穩(wěn)定干擾KLF4的RAW264.7細胞株命名為shKLF4，表達對照質(zhì)粒的細胞株命名為NC，野生型RAW264.7細胞命名為WT;
　　 2.實時定量PCR法(RT-PCR)和

11、Western-blot法鑒定干擾效率;
　　 3.RT-PCR法檢測巨噬細胞表型偏移:
　　 獲得穩(wěn)定干擾KLF4細胞株后，脂多糖LPS誘導(dǎo)巨噬細胞表型偏移，用RT-PCR法檢測巨噬細胞表型標(biāo)志物的相對表達量;
　　 4.CCK-8法測定穩(wěn)定細胞株的增殖活性;
　　 5.流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞的細胞周期及細胞凋亡;
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立穩(wěn)定干擾KLF4的細胞株，RT-PCR法

12、和Western-blot法鑒定干擾效率達70％以上，;
　　 2.RT-PCR法結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，抑制巨噬細胞KLF4的表達使M1型巨噬細胞標(biāo)志物TNF-α，MCP-1及CCL5的表達降低(P＜0.05);
　　 3.CCK-8法結(jié)果顯示，降低巨噬細胞KLF4的表達使細胞增殖活性下降(P＜0.05);
　　 4.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，抑制巨噬細胞KLF4的表達促進巨噬細胞的凋亡（P＜0.05）;