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文檔簡介
1、目的:
觀察β-連環(huán)蛋白(β-catenin,β-cat)在博萊霉素(bleomycin,BLM)致小鼠肺纖維化模型中各期的表達(dá)和可溶性Frizzled相關(guān)蛋白(SFRP4)干預(yù)后其表達(dá)的變化,進(jìn)一步探討其在肺纖維化上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epitelial-mesenchymaltransition,EMT)中的作用,從而更深入地了解肺纖維化的發(fā)病機(jī)制。
方法:
將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:
2、對照組(Cont組)、實驗組(BLM組)和可溶性Frizzled相關(guān)蛋白干預(yù)組(SFRP4組),每組20只。其中BLM組和SFRP4組為博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型組(氣管內(nèi)注射BLM5mg·kg-1,0.04ml),每組20只;Cont組為正常對照組(Cont組,20只),同時間按同樣方法氣管內(nèi)注入等體積(0.04ml)生理鹽水。造模后于第2、4、6、8、10天,SFRP4組小鼠分別腹腔注射PBS稀釋的SFRP4(10μg/ml)約0.
3、2ml。Cont組及BLM組腹腔注射等體積生理鹽水,每天1次。各組分別于第3、7、14和28天各處死5只小鼠,取肺組織做病理切片,用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠肺泡炎癥和肺纖維化的程度,以樣本堿水解法檢測肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量;免疫組化檢測不同組β-cat、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及上皮細(xì)胞標(biāo)記物上皮鈣黏素(E-cadherin,E-cad)的表達(dá),并應(yīng)用WesternBlot法測定β-cat、α-S
4、MA及E-cad的表達(dá)。
結(jié)果:
(1)Cont組的小鼠肺組織病理學(xué)檢查無明顯改變,僅炎性細(xì)胞少量浸潤,無肺泡炎性滲出,肺泡間隔無增厚,沒有成纖維細(xì)胞的增殖,無明顯的肺纖維化樣的改變。BLM組肺組織病理切片隨時間順序呈現(xiàn)由肺泡炎至纖維化的動態(tài)改變,早期帥泡炎性滲出較重,肺泡間隔中有大量的炎性細(xì)胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)變形。中晚期炎性滲出逐漸減輕,肺泡萎陷、消失,大小不等,但肺泡間隔逐漸增厚,可見成纖維細(xì)胞的大量增殖,
5、大量寬帶狀及片狀膠原纖維沉積,出現(xiàn)彌漫性纖維化病變;BLM組的腫泡炎和肺纖維化評分均高于對照組和治療組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);SFRP4組病理學(xué)檢查也按時間順序呈現(xiàn)由肺泡炎到肺纖維化的動念改變,但肺泡炎和肺纖維化的程度辦較BLM組為輕(P<0.05或P<0.01)。
(2)BLM組與Cont組相比,肺組織中羥基脯氨酸含量第7天開始上升,第28天達(dá)到峰值;與BLM組對照,在第7、14、28天時,SFRP
6、4組與其有顯著差異(P<0.01)。
(3)免疫組化示:E-Cad及α-SMA的表達(dá)主要在細(xì)胞膜上,與Cont組相比,各時間點BLM組及SFRP4組的E-Cad蛋白表達(dá)減少,并呈逐漸減少的趨勢,而α-SMA蛋白表達(dá)則增多,并隨著時問的推移其表達(dá)逐漸增多。Β-cat其大部分位于細(xì)胞膜上,而很少一部分位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。與Cont組相比,BLM組及SFRP4組各時間點β-cat蛋白在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)逐漸增加,BLM組較
7、SFRP4組較為顯著。
(4)Westernblot示:Cont組小鼠各時間點α-SMA及E-cad蛋白表達(dá)差異均無顯著性意義。BLM組α-SMA從3天起其表達(dá)逐漸增加,與Cont組相比,P<0.01,而E-cad蛋白表達(dá)隨時間增加而逐漸減少,與Cont組相比,P<0.01;SFRP4組α-SMA的表達(dá)亦呈逐漸增加趨勢,但較BLM組為輕,與BLM組相比,第14、28天P<0.05,E-cad蛋白表達(dá)隨時間增加亦逐漸減少,但
8、同時間點表達(dá)較BLM組表達(dá)為多,與BLM組相比,第7、14、28天P<0.05。
(5)Westernblot示:Cont組小鼠各時間點β-cat蛋白表達(dá)差異亦均無顯著性意義。與Cont組相比較,BLM組β-cat的表達(dá)從第3天開始增高(P<0.05),第14天達(dá)到高峰,第28天降低:SFRP4組β-cat的表達(dá)先增高后下降,但各時間點均高于Cont組(P<0.01)。與BLM組相比較,SFRP4組,β-cat的表達(dá)均下降
9、,其差異在第7、14、28天有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
(6)β-cat蛋白、α-SMA及E-cad蛋白的表達(dá)與肺纖維化上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可能有一定聯(lián)系,其中β-cat及α-SMA蛋白的表達(dá)與其呈正相關(guān),E-cad蛋白的表達(dá)與其呈負(fù)相關(guān)。
結(jié)論:
β-catenin在肺纖維化形成過程中存在高表達(dá)。同時在肺纖維化進(jìn)程中肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)行性減少,間質(zhì)細(xì)胞逐漸增加,反映在作為上皮細(xì)胞標(biāo)記物上皮鈣黏素(
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